实验四、五：目的基因的PCR扩增

1、实验四、五：目的基因的实验四、五：目的基因的pcrpcr扩增、扩增、pcrpcr产物的琼脂糖凝胶检测与产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶电泳检测一、实验目的一、实验目的1. 教学目的：pcrpcr反应、产物检测的基本原理与实反应、产物检测的基本原理与实验技术验技术2.能力目标：具有具有pcrpcr扩增体系设计、参数设置基本扩增体系设计、参数设置基本能力，掌握扩增产物检测方法能力，掌握扩增产物检测方法 二、实验原理二、实验原理1.pcr(1.pcr(聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain polymerase chain reaction)rea

2、ction)原理原理: :体外快速扩增特定基因或体外快速扩增特定基因或dnadna序列序列pcrpcr动动画画2.聚丙烯酰胺凝胶检测原理聚丙烯酰胺凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成dna分子通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有1-2bp 的dna三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂( (一一)

3、 )仪器仪器pcrpcr扩增仪、扩增仪、 琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（2,10,20,200,1000l2,10,20,200,1000l）、磁力搅）、磁力搅拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。（二）试剂、材料（二）试剂、材料 1.1.试剂：试剂：1010pcrpcr缓冲液缓冲液( (含含mg2mg2) ) 、 dntpdntp混合物、混合物、 taqtaq酶、质粒酶、质粒dnadna模模板、引物对（正向

4、引物和反向引物）板、引物对（正向引物和反向引物） 、pcr pcr 管、丙烯酰胺、过硫酸胺、管、丙烯酰胺、过硫酸胺、n,n,nn,n,n,n,n- -四甲基二乙胺（四甲基二乙胺（temedtemed）、）、tristris碱、硼酸、碱、硼酸、na2edtana2edta2h2o2h2o、冰、冰醋酸、无水乙醇、醋酸、无水乙醇、na2ohna2oh、agno3agno3、甲醛、甲醛、10 m mol/l dntp10 m mol/l dntp混合物、混合物、 5u/ul taq dna5u/ul taq dna聚合酶、聚合酶、1010 pcr buffer pcr buffer、50 xtae50

5、 xtae、引物对（鲤微卫、引物对（鲤微卫星引物对）、过硫酸铵。星引物对）、过硫酸铵。2.2.材料：材料：1ng/ ul dna1ng/ ul dna模板模板3.3.教师预备实验：引物对筛选。（教师预备实验：引物对筛选。（说明，该引物对为教师科研过说明，该引物对为教师科研过程中筛选引物对，参考文献：程中筛选引物对，参考文献：岳兴建, 邹远超，王永明等.元江鲤种群遗传多样性. 生态学报. 2013, 33(13).）4.4.储存液储存液 5 5tbetbe 、10%10%过硫酸铵过硫酸铵(ap)(ap) 、30%30%丙烯酰胺母液丙烯酰胺母液 四、实验步骤四、实验步骤(一一)pcr1.pcr方案

6、编制方案编制6 6个样本个样本/ /同学，同学，建议编制建议编制8 8个样个样本量以便分样本量以便分样 取样后取样后要标记要标记2.2.在在1.5ml1.5ml离心管中混合反应液，振荡混合离心管中混合反应液，振荡混合3.0.2mlpcr3.0.2mlpcr管加模板管加模板4. 4.分液分液n5.5.振荡混合，置于振荡混合，置于pcrpcr仪内仪内n6.pcr6.pcr仪上参数设定，仪上参数设定， runrun。（二）琼脂糖凝胶电泳检测（二）琼脂糖凝胶电泳检测pcrpcr的结果的结果（三）（三）pcrpcr产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测1.1.聚丙烯酰胺凝胶

7、电泳和银染过程中所用的溶液配制聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染过程中所用的溶液配制(1)(1)10%10%过硫酸铵过硫酸铵(ap) (ap) (2)(2)8-12%8-12%聚丙烯酰胺凝胶的配制（自行选择，建议聚丙烯酰胺凝胶的配制（自行选择，建议6%-10%6%-10%）(3)(3)染色液、显影液染色液、显影液 2.2.聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳n(1)(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装玻璃板，用清洗制胶玻璃板，烘干后，组装玻璃板，用1.0%1.0%的琼脂糖封底；的琼脂糖封底；n(2)(2)按照配方表将各组分混匀，混匀后迅速灌胶；（注意防止气泡产生）按照配方表将各组分混匀，混

8、匀后迅速灌胶；（注意防止气泡产生）n(3)(3)当胶灌至离玻璃板上缘当胶灌至离玻璃板上缘0.5 cm 0.5 cm 时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不能有气泡，室温下聚合下不能有气泡，室温下聚合1 13 3小时；小时；n(4)(4)凝胶聚合完全后，轻轻拔出梳子；凝胶聚合完全后，轻轻拔出梳子；n(5)(5)在在pcrpcr产物中加入产物中加入5 l5 l左右上样缓冲液，用微量进样器取左右上样缓冲液，用微量进样器取8l8l混混合液，加到点样孔，同时留出合液，加到点样孔，同时留出1 1个点样孔加入分子量标记物个点样孔加入分子量标记物markermarker3.3.聚丙烯

9、酰胺凝胶电泳的银染检测（聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测（4 4步）步）参考文献：梁宏伟，王长忠，李忠，等参考文献：梁宏伟，王长忠，李忠，等. . 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立的建立. .遗传遗传.2008,30.2008,30（1010）. . n1)1)电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1 1tbetbe，取出凝胶，剥到染色盒，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1 1一一2 2次次,1-2min/,1-2min/次；次；n(2)固定：加入固定液，在摇床上

10、轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器中，以便做终止使用；用双蒸水洗2次，每次漂洗时间不超过1min，洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；（通常有这步，我们省掉.why?见通过染色液、固定液配方分析）n(3)(3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min20min，然后双蒸水迅速漂洗，然后双蒸水迅速漂洗2 2次，次，每次漂洗时间不超过每次漂洗时间不超过20s20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；n(4)(4)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出

11、现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2 2次（通常是这样操作，我们使次（通常是这样操作，我们使用自来水冲洗，便可省掉下一步。用自来水冲洗，便可省掉下一步。why?why?），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；水；n(5)终止显色：把最初使用的固定液加入染色盒中，缓慢摇动5min，倒掉终止液，然后用双蒸水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次1min； n(6)(6)拍照：将胶置于凝胶成相系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照拍照：将胶置于凝胶成相系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照片用于带型分析。片用于带型分析。

12、 1）电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳）电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液缓冲液1tbe，取出凝胶，剥到染色，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗中漂洗1一一2次次,1-2min/次；次；3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗然后双蒸水迅速漂洗2次，每次漂洗时间不超过次，每次漂洗时间不超过20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；5)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带时就停

13、止显察显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗色，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作。次（通常是这样操作。使用自来水冲洗，便可省掉下一步。使用自来水冲洗，便可省掉下一步。why?），），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水五、注意事项五、注意事项n（1 1）掌握好）掌握好pcrpcr反应中的引物终浓度。引物过多会产生错误引导或反应中的引物终浓度。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体产生引物二聚体, , 过低则降低产量；过低则降低产量；n（2 2）模板量过多则可能增加非特异性产物，）模板量过多则可能增加非特异性产物，dnadna中的杂质也会影响中的杂质也会影响pcrpcr的效率。的效率。n（3 3）银染检测过程中，电泳完成、染色完成一定要用双蒸水清）银染检测过程中，电泳完成、染色完成一定要用双蒸水清洗！洗！六、实验安排六、实验安排本实验本实验1.51.5天内可做完。上午做天内可做完。上午做p