利用乳酸菌制备纳米氧化锌复合物的工艺研究

1、中北大学2016届毕业论文Study on Preparation of nano zinc oxide composites using Lactobacillus salivariusAbstract:In this experiment,the use of saliva lactic acid bacteria and zinc sulfate mixture to prepare nano - Zinc Oxide, The analysis of pH, water bath temperature, water bath time effect of reaction

2、products production,And the effect of the reaction products on the E.coli and Staphylococcus aureus were detected.Results show,Preparation of pH has a significant influence on the amount of preparation, and the water bath time and temperature on the reaction volume had no significant effect.The reac

3、tion products of the best preparation technology of water bath temperature of 75 degrees centigrade, water bath time is 25min, pH is 6.5. The reaction products were used to detect the inhibitory effect of Escherichia coli and Staphylococcus aureus.Results show,The reaction products of each group wer

4、e able to produce a clear inhibition zone to E. coli, and the possibility of acid, lactic acid bacteria, lactic acid bacteria secretion, and the antibacterial activity of zinc sulfate were eliminated,All of the products produced in the products have antibacterial effect of nano Zinc Oxide. In the fu

5、rther pathogenic bacteria growth inhibition test, each group of products can significantly inhibit the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus,The highest inhibition rate was 59.9%, the lowest was 21.5%. The 1mg/ml reaction product was the highest inhibition rate, up to 14.9%, and the l

6、owest was 4.2%.Of each product group total inhibition rate and inhibitory rate were significantly different. Combined with yield and bacteriostatic rate index, this experiment obtained by Lactobacillus salivarius of preparation of the optimal conditions for the reaction products to 55 DEG C water ba

7、th temperature, bath time 35min, pH of 5.5.Key words：Zinc Oxide,Lactobacillus salivarius,inhibition rate 目 录1 前言11.1 概述11.2 纳米技术的进展11.3 乳酸菌的生物学特征及其性质11.3.1 乳酸菌的分类11.3.2 细菌生物膜的特性21.3.3 饲用乳酸菌微生物制剂21.4 纳米氧化锌的合成21.4.1 纳米氧化锌的无机合成21.4.2 纳米氧化锌的生物合成31.4.3 纳米氧化锌的抑菌31.4.4纳米氧化锌在饲料中应用 31.5 本课题的要求、目的及意义42 材料与方法5

8、2.2 实验仪器与药品52.2.1 实验仪器52.2.2 实验药品52.3 试剂配制及灭菌52.4 实验方法52.4.1 菌种活化52.4.2 制备纳米氧化锌62.4.3 纳米氧化锌的制备工艺62.4.4 反应液中菌体活性测定82.5 反应沉淀对大肠杆菌的抑菌效果测定82.5.1 大肠杆菌抑菌圈的测定方法82.5.2 反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响82.6 反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响82.7 数据处理与统计分析93 结果与分析103.1 不同制备条件下沉淀产物质量的得率103.1.1 水浴温度对反应沉淀质量的影响及分析103.1.2 水浴时间对沉淀产物质量的影响及分析103.1.

9、3 pH对产点产物的影响及分析113.2 反应液菌体活性测定123.3 反应沉淀对大肠杆菌抑菌效果测定与分析123.3.1 反应沉淀对大肠杆菌的抑菌圈的影响123.3.2 反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响153.4 反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响173.4.1 不同水浴时间制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响183.4.2 不同pH制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响193.4.3 不同水浴温度制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响204 结论22附录A 实验设备及仪器一览表23附录B 主要药品及试剂一览表24参考文献25致谢271 前言1.1 概述 乳酸菌是一类能利用碳

10、水化合物产生乳酸的非病原性、革兰氏阳性细菌的通称，包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属。一些乳酸菌是人和动物的胃肠道和雌性生殖道的共生菌，可以促进人和动物的健康。此外，乳酸菌作为重要的益生菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中，被公认为是安全的食品级微生物1。 纳米氧化锌是一种面向21世纪的新型高功能精细无机产品，其粒径介于1100 nm，又称超微细氧化锌，是比较成熟的纳米级微量元素产品，具有一般氧化锌无法比拟的性能。纳米氧化锌在动物体内可以通过被动扩散被吸收，降低对载体及能量消耗，提高吸收利用率，降低氧化锌在饲料中的添加量。饲料中添加纳米氧化锌还能够提高机体抗氧化能力、增强免疫力、降低

11、腹泻率及提高动物生产性能2。1.2 纳米技术的进展 目前纳米产品在动物营养领域的基础性研究甚少，如不同纳米营养素的适宜需要量，吸收时有无相互作用，对理化指标和功能基因的表达有无影响等，这些问题尚未得到充分的研究3。此外，各种纳米饲料，纳米添加剂，纳米畜产品，纳米食品的安全性研究更是远远滞后于产品的开发，它们的安全性归根到底是关系到人民身体健康的丈事，必须要经过严格的评价和监控，防患于来然。如不立刻加强这些方面的研究，不能及时给消费者一个明确可靠的说法。纳米营养素的进一步开发将困难重重，纳米饲料、纳米功能食品的产业化就无法形成规模4。1.3 乳酸菌的生物学特征及其性质乳酸菌属于原核类生物中的一类

12、异养厌氧型或兼性厌氧型细菌，利用可发酵碳水化合物( 主要是葡萄糖或乳糖) 产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的总称，广泛存在于人和禽的肠道中, 能维持机体内多种微生物菌群之间的平衡，与人类的健康息息相关。1.3.1 乳酸菌的分类 从形态上分，乳酸菌可以分为球状、杆状链状、分支状三大类。如圆形或卵圆形的 和肠膜明串珠菌、分支状的双歧乳杆菌、四联状的乳酸片球菌。现在国际上普遍采取的是Bergey氏细菌鉴定手册中乳酸细菌的分类方法，凌代文5将乳酸细菌分成四大类：革兰氏阳性无芽孢杆菌、形成内生芽孢的杆菌、革兰氏阳性兼性厌氧球菌、不规则形的专性厌氧菌。1.3.2 细菌生物膜的特性 细菌生物膜是一种附着于细菌体表

13、或界面由细菌群体和包裹菌体的水合性基质组成的聚合体6，生物膜成熟后可以释放游离菌体。与普通游离细菌相比，生物膜细菌和生物膜释放细菌具有较强的抗逆性。由于生物膜细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用和对环境的抵抗能力等方面具有独特的性质7-9，生物膜的研究近年来备受重视。 细菌生物膜已在多个领域被广泛研究和应用，如环境修复工程和能源产业。然而，关于乳酸菌生物膜方面的研究和应用还相对较少，Speranza10等研究利用乳酸菌生物膜来控制软质干酪中李斯特氏菌的生长，Rangaswamy11等研究过利用德氏乳杆菌保加利亚亚种生物膜来连续生产乳酸。保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是益生菌典型代表，广泛应用于工业

14、生产，利用其生物膜或生物膜释放菌体进行生产，既可以获取优良菌体又可以节约发酵剂，提高经济效益。1.3.3 饲用乳酸菌微生物制剂 随着微生态学的不断发展，在饲料中添加微生物制剂在养殖业中得到了广泛的认可和使用。乳酸菌微生态制剂是微生物制剂的一种,指将乳酸菌培养后,用适当的方法制成带活菌的粉剂、片剂或丸剂等，具有整肠和防治肠胃疾病以及重新建立正常的肠道菌群平衡的作用。 孙笑非12等研究了乳酸菌在饲料中的运用，他指出微生物制剂在畜禽养殖业中，不仅可以作为免疫增强剂加强免疫机能，也能作为生长促进剂提高质量和成活率等生产性能。 杨琛杰13等总结了乳酸菌在微生态制剂上的研究, 添加了微生态制剂的饲料，产生

15、不饱和脂肪酸和芳香酸, 使饲料产生香味，刺激家禽的食欲；微生物能产生蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，促进食物中营养物质的吸收，提高了家禽对氮素的利用率。同时微生态制剂具有促进消化、增强免疫力、保护生态环境等特点。因此，乳酸菌作为微生物制剂在未来的养殖业中具有一定的经济效益和生态效益。1.4 纳米氧化锌的合成1.4.1 纳米氧化锌的无机合成 目前，纳米氧化锌的工业化生产方法很多，如沉淀法等，但这些传统方法多为高温高耗能，对环境破坏大 14 。而最近几年来，生物方法制备纳米材料得到了一定的发展，如 DNA分子、蛋白质、微生物、动物和植物体15 等被用来制备纳米材料，Sangeetha 等用芦荟提取物成功

16、合成纳米氧化锌材料16 。 王娜等用蛋壳薄膜作为生物活性载体，设计了一种在有生物活性材料参与的条件下室温原位合成硒化铅纳米团簇的新方法。该方法利用蛋膜上特定周期性分布的大分子与无机前驱体离子之间的螯合作用和电荷作用来控制硒化铅微晶的形成、聚集和分布，成功地制备出了具有规则形状的硒化铅纳米团簇 17 。1.4.2 纳米氧化锌的生物合成 细菌生物膜无所不在。随着人们对其认识的加深，各种针对生物膜的研究也相应展开。纳米材料技术就是其中之一。然而，在各类细菌疾病盛行的今天，绝大部分的工作者都执着于如何更有效地灭杀生物膜而忽视了生物膜自身的各种特性。生物膜是一种具有复杂化学成分，独特生物活性以及精致微米

17、/纳米结构的特殊材料。 细菌具有极高的比表面积，以及双向的钻附能力。因此，纳米阵列会优在细菌的表面上生长，可以利用这一特性实现纳米阵列在复杂基底表面的固定和传导。我们利用乳酸菌的私附能力，实现在复杂基底内壁中，致密氧化锌阵列的成核、固定与生长18。1.4.3 纳米氧化锌的抑菌 纳米ZnO颗粒（1100 nm）尺寸较小，比表面积较大，表现出非常高的化学活性、小尺寸效应、量子尺寸效应、表面与界面效应和宏观量子隧道效应，在陶瓷、化工、电子、光学、生物、医药等许多领域有重要的应用价值19 。由于纳米氧化锌的性能稳定可靠、安全无毒以及无需紫外照射就能表现出良好的抑菌活力，在抗菌方面的应用更为广泛20，因

18、此制备高质量的纳米ZnO非常重要。 喻兵权21权等人实验证明，在日光灯照射下，无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，纳米氧化锌比普通氧化锌有更好的抑菌作用。当纳米氧化锌和普通氧化锌质量分数均为5%条件下，对大肠杆菌的抑菌率分别达到97.9%和52.9%；对金黄色葡萄球菌抑菌率分别达到98.8%和68.3%.研究表明，在5分钟内，纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌的杀菌率为98.86%，大肠杆菌为99.93%，显著高于普通氧化锌。1.4.4 纳米氧化锌在饲料中应用 纳米氧化锌不仅在光化学领域有很好的应用，在食品以及动物饲料中也发挥很大作用22 。目前猪场养殖发现高锌能有效防止断奶猪仔的腹泻问题。将纳米氧化

19、锌替代普通锌源，添加在动物饲养中，其高生物活性、对肠道致病菌的抗菌性23 和吸收率可以有效地减少腹泻，降低料肉比，而且剂量更少，对环境污染小，为人类健康造福，是目前代替高锌最理想的饲料添加剂 24，在饲料行业的应用前景广阔。 胡文锋25等提供了一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂。本发明利用乳酸菌合成纳米级氧化锌后可开发一种全新的富含纳米氧化锌的饲料添加剂。这种添加剂应用于乳猪饲料中，添加量低于1000ppm（以氧化锌计）26。因此除有效防止动物锌中毒，减少锌对环境的污染之外，还能通过乳酸菌和氧化锌的共同作用，有效防止断奶猪仔的腹泻，改善肠道健康水平，甚至可以全部或

20、部分替代抗生素，减少抗生素残留，提高食品安全性能。1.5 本课题的要求、目的及意义 纳米氧化锌具有抗菌效应。本研究的任务是利用益生性乳酸菌作为反应介质，以生物方法制备纳米氧化锌。目的是得到纳米氧化锌和乳酸菌的混合物，并进一步对该混合物进行干燥、与载体混合，制备成为含有益生菌及纳米氧化锌复合功能成分的饲料添加剂。在生物技术和纳米技术之间突破新的领域。2 材料与方法2.1 实验菌种 唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius,大肠杆菌 Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus等均由中北大学发酵工程实验室保藏。2.2 实验仪

21、器与药品2.2.1 实验仪器 见附录A2.2.2 实验药品 见附录B2.3 试剂配制及灭菌2.3.1试剂及培养基配制(均是配制1000毫升所需） MRS培养基配制：称取蛋白胨10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g（固体培养基所加），加蒸馏水至1000 mL，调节pH值至6.5左右。在121的高温高压锅中灭菌15min。LB培养基配制：蛋白胨10g、酵母菌粉5g、氯化钠10g、琼脂15g（固体培养基所加），加入1000ml蒸馏水，调节

22、pH值至7.2左右。在121的高温高压锅中灭菌15min。0.1g/mL 氢氧化钠溶液配制：称取10g固体氢氧化钠，缓慢加入到100mL蒸馏水中，并不断搅拌，充分溶解。硫酸锌溶液配制：称取11.27g硫酸锌固体，缓慢加入到200mL蒸馏水中，并不断搅拌，充分溶解。2.4 实验方法2.4.1 菌种活化 将实验室保藏的唾液乳杆菌按2%的接种量接种于MRS培养基中，37培养24小时，待菌液pH达到4.5左右，镜检，若视野范围内观察到大量紫色杆状菌株，表明其活化完成。同理，将实验室保藏的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按2%的接种量接种于LB培养基中，37培养24小时，可观察到培养基变浑浊，有菌种产生。然后保

23、存到冰箱中，待用。2.4.2 制备纳米氧化锌 制备纳米氧化锌工艺流程：唾液乳酸杆菌的培养加硫酸锌调节pH值 水浴加热37培养箱静置纳米氧化锌产品 具体操作步骤如下： 将所需要以及灭菌完成的仪器和试剂放到超净工作台中，有烧杯、量筒、离心管、pH试纸、玻璃棒、硫酸锌溶液、氢氧化钠溶液等。然后打开超净工作台中的紫外经行灭菌，灭菌15min。灭菌完成后，关掉紫外，并将培养的唾液乳酸杆菌放入到超净工作台中。用酒精对我们的手进行杀菌，点燃酒精灯。然后用量筒量取一定的菌液转入到烧杯中，在量取等量的硫酸锌溶液缓慢加入到烧杯中，并不断搅拌，使两者充分混合。测出混合溶液的pH，一般都小于5，加入氢氧化钠溶液，调节

24、pH至5.5，取两支离心管，每支试管倒入10毫升混合液，并标记。依次类推。pH为6.5时，取28支离心管，每支试管倒入10毫升混合液，并标记。然后对离心管水浴加热。打开水浴锅。当温度为45时，取两支装有混合物pH为6.5的离心管放入水浴加热25min，依次类推。温度为75时，取装有混合物pH值不同的离心管全部水浴加热25min；且其中10支pH为6.5的离心管，水浴加热时间分别为5、15、25、35、45min。完成水浴加热后，将全部离心管放入到37的培养箱中陈化9小时。制得反应沉淀（纳米氧化锌粗品）。陈化完成后，得到反应液全液。将部分反应全液在3500rpm离心20min。分别得到反应液上清

25、与沉淀。将试管放到烘干箱中在100下烘4个小时，得到干燥的沉淀物。并对其经行称量，测出物质的干重。然后对其进行抑菌实验测定。2.4.3 纳米氧化锌的制备工艺2.4.3.1 不同水浴温度下纳米氧化锌的制备 在pH为6.5和水浴时间为25min的条件下，将水浴温度分为45、55、65、75、85五组，制备纳米氧化锌。如表2.1所示。 表2.1 不同水浴温度下纳米氧化锌的制备组别条件温度/培养状态组1菌液+硫酸锌溶液45静置组2菌液+硫酸锌溶液55静置组3菌液+硫酸锌溶液65静置组4菌液+硫酸锌溶液75静置组5菌液+硫酸锌溶液85静置2.4.3.2 不同水浴时间下纳米氧化锌的制备 在pH为6.5和水

26、浴温度为75条件下，将水浴时间分为5min、15min2、5min、35min、45min五组，制备纳米氧化锌。如表2.2所示。 表2.2 不同水浴时间下纳米氧化锌的制备组别条件时间/min培养状态组1菌液+硫酸锌溶液5静置组2菌液+硫酸锌溶液15静置组3菌液+硫酸锌溶液25静置组4菌液+硫酸锌溶液35静置组5菌液+硫酸锌溶液45静置2.4.3.3 不同pH下纳米氧化锌的制备 在水浴温度为75和水浴时间为25min的条件下，将pH分为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5五组，制备纳米氧化锌。如表2.3所示。 表2.3 不同pH下纳米氧化锌的制备 组别条件pH培养状态组1菌液+硫酸锌溶液5.5

27、静置组2菌液+硫酸锌溶液6.0静置组3菌液+硫酸锌溶液6.5静置组4菌液+硫酸锌溶液7.0静置组5菌液+硫酸锌溶液7.5静置2.4.4 反应液中菌体活性测定 在超净工作台中，取15个无菌干燥的培养皿，用MRS进行涂板。然后将各组的反应液用移液枪吸取100L，分别打入培养皿的中央，然后用灭菌的玻璃棒进行涂匀，并标记。再将涂好的培养皿放在37的培养箱经行培养，培养24小时候观察有无菌种生长。2.5 反应沉淀对大肠杆菌的抑菌效果测定2.5.1 大肠杆菌抑菌圈的测定方法 在超净工作台中，将灭菌完成后的LB培养基分别倒在培养皿中，等其冷却并凝固。再将我们所培养的大肠杆菌从冷藏冰箱中取出，以无菌水稀释至合

28、适浓度，用移液器吸取50L打入涂满LB培养基的培养皿中，在用无菌玻璃棒涂板到LB琼脂平板上，边涂边旋转培养皿，使其充分涂匀。再用灭菌过的打孔器在培养皿中打孔。将步骤2.5中得到的纳米氧化锌反应沉淀用500L无菌蒸馏水溶解，充分搅拌后混匀得沉淀重悬液，用移液枪吸取并打入到涂布了大肠杆菌平板的孔中，每个孔打入沉淀重悬液10L。晾干后将平板放入到37的培养箱中培养16个小时，测定抑菌圈的直径，按下式测定单位抑菌比。 单位抑菌比=抑菌圈直径/重悬液浓度 （2-1）2.5.2 反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响 取16支灭菌试管，每只管装入10mL的LB培养基，以无菌方式接入20L大肠杆菌菌液，摇匀。然后

29、用移液枪吸取2.6.1中的沉淀重悬液50L，打入到其中15支试管中，摇匀并标记。另外一支试管不加纳米氧化锌沉淀重悬液，为大肠杆菌自然生长状态的对照组。测定各组试管中刚接种时的初始OD值，每组测三次，取平均值。将所有试管放到37摇床中，培养24小时，取样测定OD值，每组测三次，取平均值。得到各组培养前后OD值的增长值，按下式测定沉淀重悬液的抑菌率和单位抑菌率。 抑菌率=（对照组OD值-试验组OD值）/对照组OD值×100% （2-2） 单位抑菌率=抑菌率/单位菌液中纳米氧化锌的量 （2-3）2.6 反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响 取16支灭菌试管，每只管装入10mL的LB培养基

30、，以无菌方式接入20L金黄色葡萄球菌菌液，摇匀。然后用移液枪吸取2.6.1中的沉淀重悬液50L，打入到其中15支试管中，摇匀并标记。另外一支试管不加纳米氧化锌沉淀重悬液，为大肠杆菌自然生长状态的对照组。测定各组试管中刚接种时的初始OD值，每组测三次，取平均值。 将所有试管放到37摇床中，培养24小时，取样测定OD值，每组测三次，取平均值。得到各组培养前后OD值的增长值，按公式2.6中测定沉淀重悬液的抑菌率和单位抑菌率。注：实验完后，在倒菌液之前向其中加入有杀菌效果的试剂，比如氢氧化钠之类的，因为其易挥发，而且对人有严重的危害。2.7数据处理与统计分析 用Excel 2010进行数据处理及分析，

31、采用t检验法进行数据间差异的多重比较,显著水平取0.05。3 结果与分析3.1 不同制备条件下沉淀产物的得率3.1.1 水浴温度对反应沉淀质量影响及分析得率以产品离心后的反应沉淀质量来计。取5支干燥的离心管，称其总重量为25.36g，平均每支试管质量为5.07g。 X=25.36/5=5.07g 当pH为6.5，水浴时间为25min时，不同水浴温度下得到沉淀物质量如表3.1所示。 表3.1 水浴温度对反应沉淀质量的影响（单位g)温度/4555657585管15.505.455.415.625.51管25.525.505.435.575.49平均5.51a5.48a5.42a5.60a5.50a

32、沉淀0.440.410.350.530.43SD0.01414210.03535530.014142130.03535530.0141421 由表3.1可以看出，在pH和水浴时间一定时，随水浴温度的增加，沉淀量有差异，水浴温度为75时，反应产物量最大；水浴温度为55时反应产物量最小。经成对t检验，二者不存在显著差异（P=0.06）。因此，水浴温度对反应沉淀的质量没有显著影响。考虑到水浴温度75时产量最大，所以选用75作为最适温度。3.1.2 水浴时间对反应沉淀质量的影响及分析 当pH为6.5，水浴温度为75时，不同水浴时间下得到反应沉淀质量如表3.2所示。 表3.2 水浴时间对反应沉淀质量的影

33、响（单位g)时间/min515253545管15.555.575.545.615.50管25.565.545.595.495.52平均5.55a5.56a5.57a5.55a5.51a沉淀0.480.490.500.480.44SD0.00707100.02121320.03535530.08485280.0141421 由表3.2可以看出，在pH和水浴温度一定时，随着水浴时间的增加，反应沉淀质量有差异，水浴时间为25min时,反应沉淀量最大；水浴时间为45min时，反应沉淀量最小。经成对t检验，二者不存在显著差异（P=0.08）。因此，水浴时间对反应沉淀质量没有显著影响。综合考虑实验效果，取

34、时间为25min为最适水浴时间。3.1.3 pH对反应沉淀质量的影响及分析当水浴温度为75，水浴时间为25min时，不同pH下得到反应沉淀质量如表3.3所示。 表3.3 pH值对反应沉淀质量影响（单位g) pH5.56.06.57.07.5管15.485.515.565.706.17管25.455.565.595.586.01平均5.47b5.53a5.57a5.59a6.09a沉淀0.400.480.500.521.02SD0.02121320.03535530.02121320.08485280.1131370 由表3.3可以看出，在水浴温度和水浴时间一定的条件下，随着pH值的增大，反应沉

35、淀有差异，反应沉淀最大的pH为7.5，最小的pH为5.5。多重检验比较，pH对沉淀量产生显著影响（P=0.03）。因此pH的大小对反应产物沉淀有显著影响。而对pH为7.5和pH为6.0；pH为7.0和pH为5.5分别经行成对t检验，求得都不存在显著性差异（P1=0.59；P2=0.08）。所以pH为7.5时，pH过大，影响了反应条件，生成不明沉淀，综合比较，试验选用pH值为6.5。氧化锌属于水不溶性物质，而在反应初期加入的硫酸锌属于水溶性物质，因此，本实验中制得的纳米氧化锌主要存在于反应沉淀中，但是沉淀中除包含目标物质纳米氧化锌外，应该还包含乳酸菌菌体以及培养基中残留的部分未溶解部分，因此，这

36、一反应产物只是氧化锌的粗品。纳米氧化锌的主要功能在于其对致病菌的抑菌功能。下面的研究关注1）反应产物中乳酸菌菌体的活性；2）纳米氧化锌粗品的抑菌性能。3.2 反应液菌体活性测定 为了检测反应中唾液乳酸菌的活性，对包含菌体的反应液进行了乳酸菌活菌检测试验。发现所有15个样品的反应液在MRS培养基中37培养24h，均无菌落生成。说明反应后唾液乳酸杆菌均无活性，分析其原因可能如下： （1）水浴温度为45以上，乳酸菌不耐高温被杀死； （2）反应底物硫酸锌本身有杀菌功能，唾液乳酸杆菌被高浓度硫酸锌杀死； （3）反应完成后生成纳米氧化锌，其本身有抑菌效果，导致菌种完全无法生长。 唾液乳杆菌在反应后没有任何

37、活性，其在反应中的作用可能是为纳米氧化锌的生成提供反应界面，其机理有待于进一步研究。3.3 反应沉淀对大肠杆菌抑菌效果测定与分析 反应完成后以硫酸锌为对照，对反应全液、反应上清液进行抑菌能力测定，发现上清液及反应全液均能在大肠杆菌平皿上产生抑菌圈，但是抑菌圈与同浓度的硫酸锌相比没有显著差异。考虑到硫酸锌为水溶性物质，而反应中添加的硫酸锌为过量添加，因此上清液和反应全液中的抑菌能力有很大一部分为硫酸锌的抑菌效果。氧化锌为水不溶性物质，因此，纳米氧化锌主要存在于反应物沉淀中。因此对沉淀进行抑菌效果分析。3.3.1 反应沉淀对大肠杆菌的抑菌圈的影响 对铺满大肠杆菌的培养皿中分别打入2.6中得到的15

38、组不同的纳米氧化锌重悬液，经24小时的培养后，得到不同大小的抑菌圈，如表3.4所示。 表3.4 反应沉淀对大肠杆菌的抑菌圈（mm） 条件1组2组3组4组5组温度时间PH 不同条件下得到反应沉淀对大肠杆菌抑菌圈进行了统计分析处理,并对两组实验数据取平均值，利用公式2-1算出单位抑菌比，如表3.5、3.6、3.7所示。 表3.5 不同水浴温度下制取氧化锌对大肠杆菌抑菌圈直径的影响（mm）温度/4555657585重悬液浓度g/mL0.880.820.701.060.86内径3.703.823.853.723.77外径8.049.047.928.537.83抑菌直径4.345.224.074.074

39、.06单位抑菌比mm/ mg·mL-14.936.365.813.844.72 表3.7 不同水浴时间下制取氧化锌对大肠杆菌抑菌圈直径的影响（mm）时间/min515253545重悬液浓度g/mL0.960.981.000.960.88内径3.374.093.553.934.01外径10.8010.3110.1810.3110.41抑菌直径7.436.226.636.386.40单位抑菌比mm/ mg·mL-17.346.356.636.647.27 表3.7 不同pH下制取氧化锌对大肠杆菌抑菌圈直径的影响（mm）pH5.56.06.57.07.5重悬液浓度g/mL0.80

40、0.961.001.042.04内径3.703.763.643.733.74外径8.107.969.749.528.55抑菌直径4.404.206.105.794.81单位抑菌比mm/ mg·mL-15.504.386.10 5.562.36为了更好观察不同组分对大肠杆菌的抑菌效果，得出最佳结论，将各组得到单位抑菌比绘制成折线图，横坐标为组分，纵坐标为单位抑菌比。如图3.1所示。 图3.1 不同条件下制取反应沉淀对大肠杆菌的抑菌效果分析：（1）由图3.1可以看出，不同条件制备的反应沉淀对大肠杆菌的生长活性都有显著的抑菌效果。(2) 就温度曲线而言，在pH和水浴时间一定时，随水浴温度的

41、变化，单位抑菌比有明显的变化趋势，说明不同水浴温度下制取的反应沉淀对大肠杆菌生长活性有明显的抑菌差异。在水浴温度为55时，单位抑菌比最大，抑菌效果最好；在水浴温度为75时，单位抑菌比最小，抑菌效果最差。由试验结果可以看出，最适水浴温度应为55。(3) 就时间曲线而言，在pH和水浴温度一定时，随水浴时间的变化，单位抑菌比变化比较平稳，可见不同水浴时间下制取的反应沉淀对大肠杆菌生长活性抑菌效果差异不明显。在水浴时间为5min时，单位抑菌比最大，抑菌效果最好；水浴时间为15min时，单位抑菌比最小，抑菌效果最差。由试验结果可以看出，最适水浴时间应为5min。(4) 就pH曲线而言，在水浴温度和水浴时

42、间一定时，随pH的变化，单位抑菌比有明显的变化趋势，说明不同pH下制取反应沉淀对大肠杆菌生长活性有明显的抑菌差异。pH为6.5时，单位抑菌比最大，抑菌效果最好；pH为7.0时，单位抑菌比最小，抑菌效果最好。由试验结果可以看出，最适pH应为6.5。而我们试验中选取的pH是6.5，故比较合理。(5) 在实验中发现，抑菌圈总体而言较小，分析原因可能是由于氧化锌为水不溶性物质，而抑菌圈的扩大则要求物质溶于水进而在培养基中扩散。因此，用抑菌圈方法可能不能完全检测反应产物的抑菌能力。下面的实验将反应产物加入含目标致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的液体培养基中，测定其对目标菌OD 值得影响，以此来反应反应产物

43、的抑菌能力。3.3.2 反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响 取16支试管，分别加入10mLLB培养基和20L菌液，前15支试管分别加入2.6中所得纳米氧化锌沉淀重悬液50L进行抑菌测定，最后一组空白为不加纳米氧化锌。的空白对照组，测出各组培养前后试管中液体的OD值，每组测三次，取平均值，求出增长值。此处，对照组OD值的增长量为目标致病菌大肠杆菌在正常情况下的菌数增加量，实验组中目标菌的生长受到纳米氧化锌抑菌能力的影响，其OD 增长与对照组相比较小。抑菌率是实验所得纳米氧化锌对目标致病菌抑制能力的指标。抑菌率为每组条件制得纳米氧化锌总体对大肠杆菌生长OD 值增长的总抑制效果，单位抑菌率为每毫升大肠

44、杆菌中添加1mg纳米氧化锌粗品后对菌体OD值增长的抑制效果。3.3.2.1 不同水浴时间制备反应沉淀对大肠杆菌OD值的影响 在pH和水浴温度一定条件下，不同水浴时间下测得OD增长值，利用公式2-2和2-3计算抑菌率和单位抑菌率，如表3.8所示。 表3.8 不同水浴时间制备反应沉淀对大肠杆菌OD值的影响时间/min培养前OD均值培养后OD均值增长值抑菌率/%单位抑菌率%/ mg·mL-1差异显著性（=0.05）50.0970.9210.82420.34.2e150.0850.8970.81221.54.4d250.2130.9420.72929.55.9b350.1610.8640.7

45、5926.65.5c450.1360.7030.70332.07.3a对照组0.0711.1051.034 将上表中单位抑菌率绘制成条形图，如图3.2所示。 图3.2 不同水浴时间制备反应沉淀对大肠杆菌的单位抑菌率 经多重比较，可知纳米氧化锌制备保温时间对大肠杆菌生长活性影响差异显著。由图3.2可以看出，在pH和浴热温度一定时，浴热时间为45min时，单位抑菌率最大，抑菌效果最强；浴热时间为5min时，单位抑菌率最小，抑菌效果最弱。而浴热时间为45min时相对抑菌效果最强。本实验中制得的纳米氧化锌沉淀中除包含目标物质纳米氧化锌，还包括菌体等其他物质。 结合前面水浴时间对纳米氧化锌沉淀的影响发现

46、，虽然水浴时间对沉淀的产生没有显著影响，但是它对抑菌效率有显著影响。说明水浴时间越长，沉淀中有效物质，即纳米氧化锌的得率越高，从而抑菌功能越强。3.3.2.2 不同pH制备反应沉淀对大肠杆菌OD值的影响 在水浴温度和水浴时间一定下，不同pH下测得OD值，利用公式2-2和2-3计算抑菌率和单位抑菌率。如表3.9所示。 表3.9 不同pH制备反应产物对大肠杆菌OD值的影响pH培养前OD均值培养后OD均值增长值抑菌率%单位抑菌率%/ mg·mL-1差异显著性（=0.05）5.50.1210.7660.64537.69.4a6.00.0960.7560.66435.88.0d6.50.088

47、0.7040.61640.48.0c7.00.1350.7340.59942.18.1b7.50.0920.6410.52249.54.9e对照组0.0711.1051.034 对上表中单位抑菌率绘制成条形图，如图3.3所示。 图3.3 不同pH制备反应沉淀对大肠杆菌的单位抑菌率 经多重比较，可知不同pH条件制备的反应产物对大肠杆菌生长活性影响差异极显著。由图3.3可以看出，在水浴温度和水浴时间一定时，pH为5.5时，单位抑菌率最大，抑菌效果最强；pH为7.5时，单位抑菌比最小，抑菌效果最弱。pH为6.5时，相对抑菌能力也比较强。3.3.2.3 不同水浴温度制备反应沉淀对大肠杆菌OD值的影响

48、在pH和水浴时间一定条件下，不同水浴温度下测得OD值。如表3.10所示。 表3.10 不同水浴温度制备反应产物对大肠杆菌OD值的影响温度/培养前OD均值培养后OD均值增长值抑菌率/%单位抑菌率% /mg·mL-1差异显著性（=0.05）450.0770.8020.72529.96.8d550.0790.7120.63538.69.4a650.0850.8490.76426.17.5b750.0880.8350.74727.85.3e850.0810.7810.70032.37.3c对照组0.0711.1051.034 对上表中单位抑菌率绘制成条形图，如图3.4所示. 图3.4 不同水

49、浴温度制备反应沉淀对大肠杆菌的单位抑菌率经多重比较，可知不同水浴温度下制备反应沉淀对大肠杆菌生长活性影响差异极显著。由图3.3可以看出，pH和水浴时间一定时，水浴温度为55时，单位抑菌率最大，抑菌效果最强；水浴温度为75时，单位抑菌比最小，抑菌效果最差。3.4 反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响3.4.1 不同水浴时间制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响 在pH和水浴温度一定条件下，不同水浴时间下测得OD增长值。如表3.11所示。 表3.11 不同水浴时间制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响时间/min培养前OD均值培养后OD均值增长值抑菌率/%单位抑菌率%/ mg·m

50、L-1差异显著性（=0.05）50.1960.4970.30159.912.5c150.1770.5160.33954.811.2d250.2030.5190.31657.911.6b350.2420.5030.26165.213.6a450.1910.5060.31558.013.2b对照组0.1370.8870.750 对上表中单位抑菌率绘制成条形图，如图3.5所示。 图3.5 不同水浴时间制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌的单位抑菌率 经多重比较，可知不同水浴时间下制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长活性影响差异极显著。由图3.5可以看出，在pH和水浴温度一定时，水浴时间为35min时，单位抑菌

51、率最大，抑菌效果最好；水浴时间为15min时，单位抑菌率最小，抑菌效果最弱。3.4.2 不同pH制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响 在水浴温度和水浴时间一定下，不同pH下测得OD值。如表3.12所示。 表3.12 不同pH制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响pH培养前OD均值培养后OD均值增长值抑菌率/%单位抑菌率% /mg·mL-1差异显著性（=0.05）5.50.2170.5970.38059.814.9a6.00.1860.5350.34953.511.1b6.50.1820.5180.33755.111.0c7.00.2170.5710.35452.810.1d7.50.1700.5840.41444.