分子标记及遗传连锁图谱

1、基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和Set the flags on the genomesSet the flags on the genomes基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和遗传图谱与物理图谱遗传图谱与物理图谱v遗传作图遗传作图(genetic mapping)(genetic mapping)：采用遗传学分析方法将：采用遗传学分析方法将基因或其它基因或其它DNADNA顺序标定在染色

2、体上构建连锁图。顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位这一方法包括杂交实验，家系分析。遗传图距单位为厘摩（为厘摩（cMcM），每单位厘摩定义为），每单位厘摩定义为1 1交换率。交换率。v物理作图（物理作图（Physical mappingPhysical mapping）：采用分子生物学技）：采用分子生物学技术直接将术直接将DNADNA分子标记、基因或克隆标定在基因组分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种作图的计算单位为厘镭（杂种作图的计算单位为厘镭（cRcR），限制性片段

3、作），限制性片段作图与克隆作图的图距为碱基对，即图与克隆作图的图距为碱基对，即DNADNA的长度。的长度。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v遗传图谱遗传图谱(genetic map)(genetic map)又称遗传连锁图谱或又称遗传连锁图谱或连锁图谱连锁图谱(linkage map)(linkage map)。 经典遗传经典遗传 学时代的遗传连锁图谱主要是以家学时代的遗传连锁图谱主要是以家系分析或不同性状个体间杂交为基础，根据系分析或不同性状

4、个体间杂交为基础，根据同源染色体上同源染色体上 等位基因的变化，通过等位基因的变化，通过计算重计算重组率组率，确定染色体上基因座位的顺序和距离，确定染色体上基因座位的顺序和距离，构建基因的连锁图谱。构建基因的连锁图谱。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基基 因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染 色体上基因色体上基因座位的顺

5、序和距离的确定，即主要通过家系分析，对座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标不同性状之间、性状与标 记之间、标记与标记之间的记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。v人类遗传图谱包括女性一种配子的人类遗传图谱包括女性一种配子的2323条染色体条染色体( (记作记作2323，X)X)和男性两种配子的和男性两种配子的2323条染色体条染色体(23 (23 ，X)X)、(23(23，Y)Y)上上的所有基因位点。的所有基因位点。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院

6、 向太和向太和v7070年代发展起来的年代发展起来的DNADNA重组技术、重组技术、8080年代发展起来的分子标年代发展起来的分子标记技术为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使基记技术为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。vDNADNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的标，大大提高图谱的 精确度、准确性。遗传图谱的绘制也因精确度、准确性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。此进入了一个崭新的时代。 v现代

7、遗传图谱的概念是由现代遗传图谱的概念是由Botstein DBotstein D等等(1980)(1980)首先提出的，在首先提出的，在此基础上，限制性片段长此基础上，限制性片段长 度多态性度多态性RFLPRFLP作为遗传图谱的第一作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世代崭新标记得以问世 。遗传图谱的第二代标记位点是大量的。遗传图谱的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（可变数量串联重复（VNTR)VNTR)，包括微、小卫星，包括微、小卫星(MS)(MS)或短串联或短串联重复重复(STR (STR 或或SSLP)SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷。第三代标记是位点极其丰富的单核苷 酸

8、多酸多态性态性(SNP)(SNP)。 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v遗传学上稳定、可见的外部特征遗传学上稳定、可见的外部特征遗传与环境、结遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。v特点：特点：直观简单直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。环节，表型差异有时难以反映基因型差异。 二、遗传标记的二、遗传标

9、记的 种类种类基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C C带、带、NN带、带、G G带等）。带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。在染色体水平揭示更多遗传变异。v特点：特点：直观、快速而经济，但变异十

10、分有限，当直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。染色体数目形态相似时难以分辨。 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和人类染色体端粒人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片的荧光原位杂交照片 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州

11、师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v种子的贮藏蛋白：种子的贮藏蛋白：v同工酶：同工酶：v等位酶：等位酶：优点：优点：经济、方便、成本较低。经济、方便、成本较低。缺点：缺点：结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时检测位点只是基

12、因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。期和环境影响。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v同工酶同工酶( (isozyme)isozyme)：由由一个以上一个以上基因座位编码的基因座位编码的酶的不同形式。催化同一种化学反应，但其蛋酶的不同形式。催化同一种化学反应，但其蛋白质本身的分子结构组成有所不同的一组酶。白质本身的分子结构组成有所不同的一组酶。v等位酶等位酶( (allozyme)allozyme)：由由一个位点一个位点的不同等位基的不同等位基因编码的同种酶的不同类型。因编码的同种酶的不同类型。p电泳可区分电泳可区分同一种酶

13、（系统）的不同变化同一种酶（系统）的不同变化。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存淀粉凝胶制备淀粉凝胶制备电泳电泳凝胶切片凝胶切片酶的组织化学染色酶的组织化学染色酶谱的记录与分析酶谱的记录与分析数据分析数据分析基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和夏腊梅同工酶谱照片夏腊梅同工酶谱照片基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭

14、州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v广义的分子标记广义的分子标记(molecular marker)(molecular marker)是指可遗传的并可是指可遗传的并可检测的检测的DNADNA序列或蛋白质。序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。v狭义的分子标记概念只是指狭义的分子标记概念只是指DNADNA标记，而这个界定

15、现在标记，而这个界定现在被广泛采纳，被广泛采纳，即现在通常所说的分子标记都是特指即现在通常所说的分子标记都是特指DNADNA标记。标记。它能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特它能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的征的DNADNA片段，它直接反映基因组片段，它直接反映基因组DNADNA间的差异。间的差异。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1 1）以）以DNADNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶

16、段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题。（2 2）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造。）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造。（3 3）数量丰富，多态性遍及整个基因组。）数量丰富，多态性遍及整个基因组。（4 4）表现为）表现为“中性中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁。必然的连锁。（5 5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。完整的信息。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环

17、境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和遗传标记（遗传标记（genetic markergenetic marker）具有多型性具有多型性易于鉴别易于鉴别与目标基因紧密连锁与目标基因紧密连锁 性状标记性状标记 色泽，色泽， 形态形态 细胞学标记细胞学标记 倒位，易位，倒位，易位，G/N/CG/N/C带带 生化标记生化标记 同功酶同功酶 分子标记分子标记 RFLPRFLP、RAPDRAPD、SSRSSR、AFLPAFLP、SNPSNP 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和第一类是以第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术分子杂交

18、为核心的分子标记技术，包括：包括：v限制性片段长度多态性标记（限制性片段长度多态性标记（Restriction Restriction fragment length polymorphism, fragment length polymorphism, 简称简称RFLPRFLP标记）；标记）；vDNADNA指纹技术（指纹技术（DNA FingerprintingDNA Fingerprinting）；）；v原位杂交（原位杂交（in situ hybridizationin situ hybridization）等。）等。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科

19、学学院 向太和向太和第二类是第二类是以聚合酶链式反应（以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,Polymerase chain reaction ,简称简称PCRPCR反应）为核心的分子标记技术反应）为核心的分子标记技术，包括，包括v随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA标记（标记（Random amplification Random amplification polymorphism DNA, polymorphism DNA, 简称简称RAPDRAPD标记）；标记）；v 简单序列重复标记（简单序列重复标记（Simple sequence repeat,

20、 Simple sequence repeat, 简称简称SSRSSR标记）或标记）或简单序列长度多态性（简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, Simple sequence length polymorphism, 简称简称SSLPSSLP标记）；标记）；v扩展片段长度多态性标记（扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length Amplified fragment length polymorphism, polymorphism, 简称简称AFLPAFLP标记）；标记）；v序标位（序标位（Sequence

21、tagged sites, Sequence tagged sites, 简称简称STSSTS标记）；标记）；v序列特征化扩增区域（序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, Sequence charactered amplified region, 简称简称SCARSCAR标记）等。标记）等。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和第三类是第三类是一些新型的分子标记一些新型的分子标记，如：，如：v单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（Single nuleotide Single nuleo

22、tide polymorphism, polymorphism, 简称简称SNPSNP标记）；标记）；v表达序列标签（表达序列标签（Expressed sequences tags, Expressed sequences tags, 简简称称ESTEST标记）等。标记）等。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 Botstein再次提出。1983年Solle

23、r和Beckman最先应用于品种鉴别和品系的纯度的测定。v自从人的RFLP图谱构建后，已经分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。l一、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)标记技术的原理基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v特定生物类型的基因组特定生物类型的基因组DNADNA经某一种限制性内切酶完全经某一种限制性内切酶完全酶解后，会酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段产生分子量不同的同源等位片段，或称限制，或称限制性等位片段。性等位片段。v RFLP RFLP

24、标记技术的基本原理就是标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和通过电泳的方法分离和检测这些片段检测这些片段。v凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段和去除酶切位点）和一段DNADNA的重新组织（如插入和缺的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生等位片段的变化，从而产生RFLPRFLP。 即：物种的基因组即：物种的基因组DNADNA在限制性内切酶作用下，产生相在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射

25、性同位素标记的当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNADNA作作探针，把与被标记探针，把与被标记DNADNA相关的片段检测出来，从而构建相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。出多态性图谱。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和A A samplesample : 5 : 5 AG-GAATTC-GAAT AG-GAATTC-GAATT TC-GAATTC-CG 3C-GAATTC-CG 3 3 3 TC-CTTAAG-CTTA TC-CTTAAG-CTTAA AG-CTTAAG-GC 5G-CTTAAG-GC 5 AG- AG-

26、G G AATTC- AATTC-G G AATTC- AATTC-G G AATTC-CG AATTC-CG TC-CTTAA TC-CTTAA G G-CTTAA -CTTAA G G-CTTAA -CTTAA G G-GC-GCB B simplesimple : 5 : 5 AG-GAATTC-GAAT AG-GAATTC-GAATC CC-GAATTC-CG 3C-GAATTC-CG 3 3 3 TC-CTTAAG-CTTA TC-CTTAAG-CTTAG GG-CTTAAG-GC 5G-CTTAAG-GC 5 AG- AG-G G AATTC-GAATCC- AATTC-GAATC

27、C-G G AATTC-CG AATTC-CG TC-CTTAA TC-CTTAA G G-CTTAGG-CTTAA -CTTAGG-CTTAA G G-CG-CG基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和lAlBlAlBl限制性内切酶位点l与放射性探针结合部位l 限制性内切酶酶切后；l 电泳分离DNA片段；l 转移至硝酸纤维素薄膜；l 与放射性探针杂交，l 分析阳性条带基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 DNA限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切 电泳电泳转移到硝酸纤维素滤膜转移到硝酸纤维

28、素滤膜 同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小胶片放射自显影，显示酶切片段大小基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和vDNADNA提取：提取：v酶切：酶切：3-5 ug DNA3-5 ug DNA，以以20 20 U U内切酶酶切内切酶酶切6 6小时小时至过夜。至过夜。 v电泳：电泳：0.6-0.8%0.6-0.8%琼脂糖胶琼脂糖胶30-60 30-60 V V电泳电泳6 6小时至小时至过夜。过夜。v染色观察：染色观察： 酶切电泳印迹基因组学基因组学 杭州师范大学

29、生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v变性：变性： 脱嘌呤：脱嘌呤：0.25 0.25 mol/Lmol/L中脱嘌呤，中脱嘌呤，10 10 minmin。变性：变性：0.5 0.5 mol/L NaOHmol/L NaOH， 1.5 1.5 mol/L NaClmol/L NaCl，45 45 minmin。水冼；水冼；中和：中和：1 1 mol/Ltris-HCl (pH7.5) mol/Ltris-HCl (pH7.5) ，1.5 mol/L NaCl1.5 mol/L N

30、aCl，30min30min。v印迹：印迹：用用10 10 SSC SSC ，进行进行Southern Southern 印迹印迹v冲洗：冲洗：以以2 2SSC SSC 冼胶，风干冼胶，风干基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v预杂交：预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、将杂交膜放人预杂交液（水、5 5 HSBHSB、DenhardtDenhardt）中，中， 封好后置封好后置6565温温箱中振荡箱中振荡5 56 6小时。小时。v杂交：杂交：预杂交液

31、中加入标记好的预杂交液中加入标记好的markermarker和探和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置6565温箱中振荡过夜。温箱中振荡过夜。v洗脱：洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 65 振荡洗脱两次（振荡洗脱两次（1515min/min/次）次），吸干包好。吸干包好。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v将洗脱好的杂交膜置于增感屏上将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, , 于暗室中将于暗室中将 X-X-光片放于杂交膜上，光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，再放上另一张增

32、感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置装人暗袋，并用夹板夹好。置-80-80超低温冰超低温冰箱中曝光过夜至箱中曝光过夜至1010天左右。天左右。v使用磷屏仪，操作更方便。使用磷屏仪，操作更方便。v用计算机处理得到的数据信息用计算机处理得到的数据信息基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v来源：来源：cDNAcDNA探针与基因组探针与基因组DNADNA（gDNAgDN

33、A）探针探针cDNAcDNA探针探针: : 保守性较强，探针检测的多态性频率保守性较强，探针检测的多态性频率较低。较低。gDNAgDNA探针探针: : 检测的多态性频率较高，但不同种属检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。特异性较强。如：如：水稻水稻RFLPRFLP探针可以在下列网页获取：探针可以在下列网页获取： 玉米玉米RFLPRFLP探针可以在下列网页获取：探针可以在下列网页获取： /probes. html /probes. html基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生

34、命与环境科学学院 向太和向太和v标记物：放射性和非放射性两种标记物：放射性和非放射性两种v放射性：放射性： v非放射性：生物素、地高辛素、荧光素非放射性：生物素、地高辛素、荧光素 放射性同位素标记：放射性同位素标记： 灵敏度高，成本低灵敏度高，成本低 但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制但操作不便，标记效率不太稳定，寿命受半衰期限制 非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）：非放射性标记（地高辛、生物素、荧光素等）： 安全，标记稳定，探针寿命较长安全，标记稳定，探针寿命较长 但灵敏度较低，背景较高，成本高但灵敏度较低，背景较高，成本高l32P、35S和3H 基因组学基因组学 杭州师范

35、大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v（1）随机引物法v（2）切口平移法 v（3）末端标记法v（4）单链DNA探针标记v（5）寡核苷酸探针标记法 标记方法基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v25 25 ngng变性变性DNA DNA v5 5 uL uL 寡聚核苷酸寡聚核苷酸v2 uL BSA2 uL BSAv3 uL -3 uL -3232P dCTP P dCTP v2 2 uL KlenowuL Klenow酶酶v加水至加水至50 50 uLuL，3737中标记反应中标记反应2 h2 h。基因组学基因

36、组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和q RFLP标记技术所用的仪器设备l 杂交箱l 紫外交联仪l 同位素检测仪l 水浴及摇床l 电泳及转膜装置基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和优点：v共显性，可以区别纯合和杂合基因型。v 稳定、重复性强。v某些植物中开发探针已遍及整个基因组。缺点：vDNA需要量较大，技术复杂。v用于做图较费时，难以分析大量样品。v在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和

37、向太和主题一、主题一、RAPDRAPD标记技术标记技术基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和vRAPD (RRAPD (Randomandom A Amplifiedmplified P Polymorphismolymorphism D DNANA) )：Williams Williams (Du Pont)(Du Pont)等于等于19901990年创立。年创立。Williams J G K et al, Nucl Acids Res, 1990(18):6531 v其基本原理基于其基本原理基于PCRPCR技术：技术： RAPDRAPD

38、标记技术就是用一个随机引物（标记技术就是用一个随机引物（1010个碱基左右）非定点个碱基左右）非定点地扩增基因组地扩增基因组DNADNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组遗传材料的基因组DNADNA如果在特定引物结合区域发生如果在特定引物结合区域发生DNADNA片片段插入、缺失或碱基突变，就有段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致布发生相应的变化，导致PCRPCR产物增加、缺少或发生分子量产物增加、缺少或发生分子量变化。变化。若若PCRPCR产物增加或缺少，产物增加或缺少，则产生则产生RAPD

39、RAPD标记。标记。 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 二二、PCRPCR技术技术-回顾：回顾：PCR(PCR(P Polymerase olymerase C Chain hain R Reaction)eaction)技术：技术：vThree steps:Three steps: denaturation, denaturation, primer annealing, primer annealing, polymerization. polymerization.vP Peoples eoples C Choice hoice

40、 R Reactioneaction基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 95 95o oC step toC step to denature denature the duplex DNA, the duplex DNA, An An annealingannealing step of around 55C to allow step of around 55C to allow the primers to bind,the primers to bind, 72 72o oC C polymerization polymeriz

41、ation step. step. Mg Mg2+2+, dNTPs, dNTPs are required in addition to are required in addition to template,primers,buffer and enzymetemplate,primers,buffer and enzyme基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和vTemplate (DNA/cDNA),Template (DNA/cDNA),vprimers,primers,vTaq enzyme,Taq enzyme,v1010PC

42、R buffer, with PCR buffer, with MgMg2+,2+,vdNTPsdNTPspre-denaturation-pre-denaturation-denature completelydenature completelyDenaturationDenaturationannealingannealingElongationElongationcycles: 25-30cycles: 25-30基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和u PCR reaction components and their funct

43、ions PCR reaction components and their functionsp template template： ssDNA, dsDNAssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA mRNA needed to be RT as cDNAsamplessamples：from blood,sperm or any other from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from tissue,from older forensic spec

44、imens, from ancient biological samples or in the lab. From ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques.bacterial colonies or phage plaques.DNADNA：very stablevery stable基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和q primersprimersIf the PCR product is to be clo

45、ned, it is If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5restriction enzyme sites within the 5-ends -ends of the primers.of the primers.Can amplify fragments over 10kb in lengthCan

46、amplify fragments over 10kb in lengthStore:Store:纯化引物在纯化引物在2525乙腈溶液中乙腈溶液中44；冻；冻干引物于干引物于-20-20可保存可保存1-21-2年，液体状态于年，液体状态于- -2020可保存可保存6 6个月。不用时应个月。不用时应-20-20保存。保存。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和 Primer design Primer designMost important!Most important!(1)(1)length:length: 20 2030bp30bp(

47、2)(2)G+C contents:G+C contents:ATCG random distributedATCG random distributed(3)(3)primers :primers : no complementary sequence no complementary sequence(4)(4)3 3end of the primer:end of the primer: no modification no modification(5)(5)5 5end of the primer:end of the primer:product lengthproduct len

48、gth，can becan be modified modified(6) (6) specificity:specificity:less than 70% homology with non-less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bpspecific amplification sequence, or 8bpcontinuous complementary basecontinuous complementary base基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环

49、境科学学院 向太和向太和 Primer designed with the help of Primer designed with the help of computercomputervDNA databaseDNA databasevconservative region comparision, blast conservative region comparision, blast vPrimer designed softwarePrimer designed software基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和q buff

50、er buffer：10-50 mmol/L 10-50 mmol/L Tris-HClTris-HCl(pH8.3-8.8, 20)(pH8.3-8.8, 20)。1.5-2.5 mmol/L1.5-2.5 mmol/L Mg Mg2+2+： forfor Taq polymerase activityTaq polymerase activity Low Low conc.: low activityow activity high high conc. : non-specific amplification: non-specific amplificationq dNTPsdNTPs

51、：贮备贮备dNTPdNTP液液：1 mol/L NaOH 1 mol/L NaOH 调调pHpH至中性。贮备浓度至中性。贮备浓度为为5-10mmol/L5-10mmol/L，终浓度为，终浓度为20-200 umol/L20-200 umol/L，分装，分装-20-20保存。保存。4 4种种dNTPdNTP浓度应相同。浓度应相同。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和q Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase：from thermophilic bacteria. from thermophilic bact

52、eria. Taq polymerase from Taq polymerase from Thermus aquaticusThermus aquaticus. .other thermostable DNA polymerase with other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.greater accuracy used for certain applications.基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太

53、和v分离分离: : 19691969年，美国黄石国家公园温泉。年，美国黄石国家公园温泉。v分子量分子量: : 94KDa94KDav活性：活性：在几种水生栖热菌中活性最高，在几种水生栖热菌中活性最高，200000U/mg200000U/mgv离子需要：离子需要：对对MgMg2+2+、单价离子性质和浓度较单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为敏感。最适浓度为50mmol/L50mmol/Lv忠实性忠实性: : 没有校正单核苷酸错配功能没有校正单核苷酸错配功能- -致命弱点。一致命弱点。一般出错率为般出错率为2 21010-4-4核苷酸核苷酸/ /每轮循环，利用每轮循环，利用PCRPCR克隆、克隆

54、、测序时尤应注意。测序时尤应注意。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和v抑制剂抑制剂: : 尿素、乙醇、尿素、乙醇、DMSODMSO、DMFDMF、甲、甲酰胺、酰胺、SDSSDS及许多其他化学药剂。及许多其他化学药剂。v内源内源DNA:DNA: 不同来源的酶可能由于制备过不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌程中残留的原细菌DNADNA或或PCRPCR产物的污染产物的污染而含有不明来源的而含有不明来源的DNADNA。在使用扩增保。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。出现扩增带

55、。v保存保存: : 在在-20-20至少至少6 6个月。个月。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和Selection for DNA polymeraseSelection for DNA polymeraseKlenowKlenow酶酶早期采用早期采用该酶不耐热，缺点有该酶不耐热，缺点有: :温度要求低温度要求低(37)(37)，受热即失活；，受热即失活；产物特异性不高；产物特异性不高；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；扩增的最长序列约扩增的最长序列约400bp400bp（TaqTa

56、q酶则能扩增酶则能扩增10kb10kb）基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和thermostable DNA polymerasesthermostable DNA polymerasesTaq DNA polymeraseTaq DNA polymeraseTth DNA polymeraseTth DNA polymerasefrom from T.thermophilusT.thermophilusVENT DNA polymeraseVENT DNA polymerasefrom from T.litoralisT.litoral

57、isSac polymeraseSac polymerasepfu polymerasepfu polymerase基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和qmineral oil基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和q PCR optimization PCR optimization变性温度和时间变性温度和时间92-9592-95，富含，富含G G和和C C的序列，可适当提高，但过高或的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。时间过长都会导致酶活性损失。退火温度与时间退火

58、温度与时间引物中引物中G G、C C含量高、含量高、 长度长并与模板完全配对时，长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-37-5555、1-21-2分钟。分钟。延伸温度和时间延伸温度和时间温度：温度：7272，接近，接近TaqTaq酶的最适酶的最适7575时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的时间：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。目的序列，则可适当增加时间。循环次数循环次数循环过多，非特异性产物大量增加循环过多，非特异性产物大量增加基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学

59、学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太和向太和PCRPCR技术技术发展速度惊人，没有一种技术发展速度惊人，没有一种技术能与之相比。能与之相比。PCRPCR技术技术是目前引用论文最多的技术，是目前引用论文最多的技术，应用范围十分广泛。应用范围十分广泛。PCR PCR 技术技术19931993年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖（MullisMullis），与开创了），与开创了“寡核苷酸基因定寡核苷酸基因定点诱变点诱变”加拿大籍英国科学家加拿大籍英国科学家Michael Michael SmithSmith共获共获 。 基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院

60、向太和向太和三、三、RAPDRAPD技术与常规技术与常规PCRPCR不同的地方：不同的地方：引物长度短：引物长度短：常规常规PCRPCR中需要两个引物，长度中需要两个引物，长度20-3020-30个核苷酸。个核苷酸。 RAPDRAPD只需一个引物，长度只需一个引物，长度9-109-10个核苷酸，而且个核苷酸，而且是随机引物。是随机引物。退火温度低：退火温度低：RAPDRAPD引物短，因此退火温度要低，一般为引物短，因此退火温度要低，一般为35-35-3737。扩增结果可以是扩增结果可以是1 1至多条带至多条带。基因组学基因组学 杭州师范大学生命与环境科学学院杭州师范大学生命与环境科学学院 向太