医学遗传学：第16章 遗传病的诊断

1、Chapter 16 Diagnosis of Genetic DisordersDNA-based methods do not replace haematological and biochemical investigations形态学家族史血常规 （MCV,MCH）生化检测基因检测//sites/genetests/Gene Diagnosis 基因诊断-指利用分子生物学技术，检测体内DNA或RNA在结构或表达水平上的变化，从而对疾病做出诊断的方法，通常又 称 为 分 子 诊 断 ( M o l e c

2、u l a r Diagnosis)。/yuet.kanThe Father of Gene Diagnosis简悦威简悦威Strategies for Gene Diagnosis基因诊断的策略1. 直接诊断：直接检测突变2. 间接诊断：连锁分析（Linkage Analysis）ATP7BD13S313D13S314D13S316PaternalMaternalAaAaD13S313PMSonFetus1234基因产物水平诊断举例：1. 654地中海贫血（见，p299）2. BCR-ABL融合基因基因诊断的技术q染色体水平q大片

3、段缺失 重复q基因倒位q基因融合q小片段缺失 重复q点突变q碱基修饰核酸分子杂交聚合酶链式反应（PCR)基因芯片基因测序 核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）1. 来源不同的DNA（或RNA）片段，按照碱基互补关系形成异源双链分子的过程。2. 探针（Probe）：带有某些标记物的特异性核酸序列片段3. 来源：DNA，cDNA，人工合成的寡核苷酸片段4. 基本方法：印迹杂交和点杂交Southern印迹杂交 Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。 是由Alwine于1977年建立的

4、。后经Thomas等人改进。 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况。Northern印迹杂交Northern印迹杂交流程图 与Southern印迹杂交比较： RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA 2-OH 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态点杂交正向：是将待检样（DNA、RNA 或细胞）直接点到膜上，烘烤固定反向：是将探针固定点杂交（Dot-Blot）q点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速。q特别适合做点突变反向点杂交（Reve

5、rse Dot-Blot） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性退火延伸三个基本反应步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR 循环- 第一步 加热变性PCR 循环- 第二步 引物与模板DNA分子退火Primer 1Primer 253553533PCR 循环- 第三步 - 引物延伸Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列30次循环后靶序列扩增的数量循环数循

6、环数 扩增产物量扩增产物量 （2n）121222243238424165253262664202201,048,576302301,073,741,824模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7PCR原理示意图1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温

7、延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA94PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9555引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR

8、反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增p在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。p如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需24min， 23h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。p实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。p在PCR反应体系中，Real-time PCR的荧光标记物可分为两种：荧光染

9、料标记和荧光探针标记。1. 荧光染料法p SYBR荧光染料 (SYBR Green based Quantitative PCR) 能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。 q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR

10、Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 53激发激发53SG发射发射SGSGSGSG5353激发激发SGSGSG发射发射SGSG不掺入双链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链,发出荧光信号Taqman技术 （TaqMan probe） 2. 荧光探针法与目标序列互补与目标序列互补5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针3端的荧光Q分子吸收

11、5端荧光R分子的荧光信号 探针5端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5353QRQ53R53激发激发5353激发激发RQ引物Taq 酶DNA Microarray DNA芯片技术DNA Microarray DNA芯片技术 荧光原位杂交Fluorescence in situ hybridization 比较基因组杂交Comparative genomic hybridization（CGH） 多重探针连接扩增Multiplex ligation-depe

12、ndent probe amplification(MLPA) 单链构象多态性Single Strand Conformation polymorphism（SSCP） 变性高效色谱分析Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) DNA sequencing第一代：双脱氧核苷酸末端终止法Born13 August 1918Rendcomb, Gloucestershire, EnglandDied19 November 2013 (aged 95)Cambridge, E

13、ngland第二代：焦磷酸测序（Pyrosequencing） DNA sequencing DNA sequencing第三代：单分子实时测序（Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT)The DNA sequencing is done on a chip that contains many ZMWs (Zero-mode waveguide)Inside each ZMW, a single active DNA polymerase with a single molecule of single stra

14、nded DNA template is immobilized to the bottom The signal from a phospho-linked nucleotide incorporated by the DNA polymerase is detected as the DNA synthesis proceeds which results in the DNA sequencing in real time Developed by Pacific Biosciences 15-minute, $100 human genome sequencing 开展个体化诊断与治疗

15、依赖于基因/基因组序列 第一代测序技术：双脱氧核苷酸末端终止测序法 一个测序反应可读有效长度：500bp 1000bp（1Kb） 完成一个人基因组测序：3000000Kb（3000Mb） 费用：20元3000000 6000万元 第二代测序技术：焦磷酸测序技术（高通量） Roche 454，运行1次可测 1000000Kb/1万美元（3万美元） Illmina，运行1次可测 2个人的基因组（3万美元），8 day 第三代测序技术（纳米、单分子、实时） 费用：30亿美元 3010万美元？ 1000美元100美元 测序时间： 15年 6周 1周 ？ 60分 15分 0 反转录PCR

16、（RT-PCR）16.5.3 基因诊断的实例1. 杜氏肌营养不良 （Duchenne muscular dystrophy ）-Deletion； Multiplex PCR/MLPA2. 镰状细胞贫血 （Sickle cell anemia）-Point mutation； Southern Blot/PCR-RFLP3. 654地中海贫血 （ 654 thalassemia）-Aberrant Splicing; RT-PCR4. 血友病A （Hemophilia A）-Linkage analysis5. 脆性X综合征 （Fragile X syndrome）-Trinucleotide

17、 repeat； Southern Blot 杜氏肌营养不良 （Duchenne muscular dystrophy ）Xp21.2-p21.153PatientsSt(-)(+)12345DMD GENEagfbhcdea b c d e f g h . 镰状细胞贫血 （Sickle cell anemia）ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGA

18、CCAATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCARestriction fragment length polymorphism (RFLP)Southern Blot300bp200bp500bpPCR-ASO反向点杂交（Reverse Dot-Blot）RT-PCR 654地中海贫血 （654 thalassemia） 血友病A （Hemophilia A, HA）99bp43bp142bpBcl IBcl I142bp 血友病A （Hemophilia A, HA）16.5.4 遗传病的诊断时机1.症状前诊断（Asymptomatic diagnosis）2.产前诊断 （Prenatal diagnosis）3.着床前诊断 （