基因组文库构建PPT学习教案

1、会计学1基因组文库构建基因组文库构建cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA文库。第1页/共53页第2页/共53页 组织 载体 ( 选择一种) mRNA DNA cDNA 部分或完全 消化的 DNA 甲基化，加接头 的双链 DNA 大小分级 可供克隆的 DNA 片段 连接 DNA 片段和载体 重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化) 基因库的鉴定与效价测定 筛选目的基因 扩增文库长期保存 构建基因组 DNA 和 cDNA 文库的流程示意图 第3页/共53页第4页/共53页第5页/共53页DNA群体按大小分部分离。三.目的基因克隆片段的富集。第6页/

2、共53页G: 基因组DNA的总长度，如人类为3109bp)/1ln()1ln(GIpN第7页/共53页)30/171ln()99. 01ln(MbkbN第8页/共53页第9页/共53页n可用多种策略进行筛选。第10页/共53页于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。第11页/共53页oligo(G)为引物起始第二链的合成。这样产生的双链cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。第12页/共53页 AAAAAAA mRNA (a) 随机六碱基 (b)寡聚(dT)引物 第一条 cDNA 的合成 An An NNNNNN Tn (c)发夹引物 (d)同聚物加尾

3、反应 第二条 cDNA 的合成 TTTTTT GGGGGG TTTTTT CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG TTTTTT AAAAAA CCCCCC AAAAAA 切除发夹 通过以下途径将 cDNA 插入载体 a. 平端克隆 TTTTTT b. 加接头 AAAAAA c. 进一步进行同聚物加尾反应 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克隆 第13页/共53页体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。第14页/共53页置换载体:基因组DNA克隆。第15页/共53页n主要应用：基因组文库构建。第16页/共53页 真核基因组 DNA 取代型噬菌体载体

4、COS Charon 4A 机械剪切 EcoRI EcoRI 酶切 加人工接头 酶切 连接 cos cos 体外包装 转染 E.coli 第17页/共53页双链质粒 DNA5 3 AAAAAAn 加锚定引物(寡聚 T) pBR322 5 3 AAAAAn 3 5 TTTT RT 酶 限制酶 用 NaOH 降解 mRNA 用 Klenow 酶合成第二链 SI 酶降解发夹结构末端转移酶dGTP 末端转移酶加寡聚 C CCC CCC GGGGGG 连接 转化 E.coli 扩增 以质粒为载体构建 cDNA 文库第18页/共53页 基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较基因组作图中使用的高容

5、量人工染色体克隆载体的比较。载体系统克隆容量评价YAC(酵母人工染色体)酵母着丝粒,复制起始点和端粒200kb2Mbp嵌合发生率高(在基因组中不相连的连续片段)；不稳定(自发缺失)；很难与酵母染色体分离；PAC(P1 人工染色体)细菌噬菌体 P1100300kbBAC(细菌人工染色体)F 质粒300kb稳定，但在细菌外难以维持MACs(哺乳类人工染色体)基于 Epstein-Barr 病毒的游离载体300kb 人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAECHAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒第19

6、页/共53页第20页/共53页 HindIII Cos NotI NotI Z T7 SP6 ParC CMr HindIII 部分酶切 ParB BAC oriS ParA PFGL repE HindIII CIP Pulsed-field gel electrophoresis 连接第21页/共53页第22页/共53页菌体P1溶菌循环扩增。第23页/共53页n评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。第24页/共53页 CEN4 EcoRI ARSI SUP4 TRPI Amp URA3 DNA ori

7、 EcoRI 部分酶切 TEL TEL BamHI BamHI BamHI 和 PFEG(pulsed field gel Ecoli 双酶切 electrophorcsis ) 脉冲电泳 变角电场电泳 连接 第25页/共53页(2)用免疫和生化方法来检测基因产物；(3)用特异性引物进行PCR扩增。第26页/共53页第27页/共53页表 24.4 根据所提供的来源和信息，从 cDNA 或基因组文库中分离基因的策略所提供的信息所提供的信息筛选策略筛选策略功能克隆功能克隆- -不需要表达不需要表达高度度 mRNA丰富克隆从 cDNA 文库中随机选择克隆，测序确定产物已知部分序列用寡核苷酸探针筛选a

8、有部分克隆或同源序列在低严格条件下用克隆的片段或同源基因筛选已知部分多肽序列用简并性寡核苷酸猜测体猜测体(guessmers)筛选文库两种组织中表达差异差减筛选，通过差减杂交得到富含差异表达克隆的文库cDNAcDNA 表达的功能克隆表达的功能克隆提供突变通过对突变表型的互补筛选(表型恢复)提供抗体同免疫检测筛选文库特异性的产物通过特殊技术筛选文库，如对 DNA 结合蛋白的 southweatern 杂交，相互作用蛋白的酵母双杂交体系，酶对底物的转化等定位克隆定位克隆提供结构突变如果突变由缺失引起，从基因组消减文库来克隆由转座子插入引起的突变如果突变由插入或转座子件引起，用转座序列作为探针筛选突

9、变体文库，通过质粒拯救分离克隆基因在染色体上的位置通过从相关标记或染色体断点相连接的染色体步移(chromosomewalking,)定位克隆，标记可能是增强子包载载体的转座因子非筛选方法非筛选方法基因组作图和测序对整个基因组系统化分析表达序列标记对随机 cDNA 克隆的大量克隆和分析a 以 PCR 为基础的方法也可应用第28页/共53页可用H；应用混合探针；控制退火温度。第29页/共53页第30页/共53页第31页/共53页TC CTAGAGAGCT 保守的氨基酸序列 CysMetAspGluMetLysArgAsnIle 特异的 DNA 序列 A TG -ATG-GA -GA -ATG-A

10、A -AG AA -ATT C 简并的探针含 8 种不同序列 A CGC TGTATGGATGAAATGAA G TGCATGGATGAAATGAA T TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGACGAGATGAA 同 cDNA 文库杂交 唯一的“猜测体”5 TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3 同克隆基因杂交的正确序列 5 TGCATGGACGAATGAA 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG 猜

11、测体与克隆基因杂交存在错配 G C5 TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC 3 ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG T A 事实上的 DNA 序列5 TGCATGGACGAAATGAAGCGCAATATC 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG 第32页/共53页n提高杂交温度，以减少假阳性。第33页/共53页隆。此猜测体探针是按32aa序列推导猜测而来的。分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。用这段插入序列为探针，在严格条件下筛选噬菌体cDNA文库。第34页/共53页 32aa 尿酸氧化酶 猪肝 mRNA 以 32aa 两侧序

12、列 为根据,合成两组 RT 简并引物 cDNA 用简并引物特异扩增猪肝的 cDNA 混合连接，克隆 PCR 扩增产物 用猜测体探针 从重组质粒中切下 筛选阳性克隆 插入序列 以插入序列为探针 筛选 cDNA 文库第35页/共53页库进行筛选。第36页/共53页 表达目的基因的细胞 不表达目的基因的细胞 RT 提取 mRNA cDNA 提取 mRNA 制备带有放射 重组到 制备带有放射 标记的 cDNA 探针 载体上 标记的 cDNA 探针 与影印的 NC 转染 E.coli 与影印的 NC 进行分子杂交 构成 cDNA 文库 进行分子杂交 影印 影印 放射自显影 放射自显影 比对 比对 筛选出

13、含目的基因的阳性克隆第37页/共53页第38页/共53页 野生型 DNA 缺失突变型 A B C A C 基因组 DNA 剪切 用生物素标记 A B C 过量 变性，退火杂交 A C B 过生物素柱 裹着生物素 的小磁珠 生物素柱 未结合的 DNA B B B 加接头，PCR 扩增 重组，转化，形成克隆库第39页/共53页 (1) 从一对不同的组织或器官中分离总 mRNA,分别称为 A 组和 B 组， 并同时进行以下反应 mRNA 5 GCAAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTTTTTT 5 RT 酶 3 锚定引物(5 TnGC3 ) 5 GCAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTT

14、TTTT 5 5 随机引物 3 CGTTTTTTT 5 3 锚定引物(5 TnGC3 ) 5 端随机引物 放射性标记 dNTP 5 GCAAAAAA3 3 CGTTTTTTT5 第40页/共53页 A B A 组特有的条带 B 组特有的条带 A,B 共有但丰度不同的条带DDRTPCR第41页/共53页第42页/共53页 噬菌体,粘粒 或质粒文库 影印到 NC 膜上 进行分子杂交或免疫反应 纯化噬菌斑和菌落 第43页/共53页 母板 影印到 NC 上 目的蛋白抗抗体 目的蛋白抗体 放射自显影的 X 光片 利用抗体筛选表达文库第44页/共53页第45页/共53页第46页/共53页(4)此可通过染色

15、体跳跃(chromosome jumping)来克服。第47页/共53页 RFLP克隆 目的基因 分离起始克隆 构建起始克隆的限制图 E H B B H 亚克隆BH 限制片段 用同位素标记BH 限制片段为探针，从文库中筛选相邻的重叠序列克隆 构建相邻克隆的限制图 B H H E 亚克隆HE 限制片段 用同位素标记HE 限制片段为探针,筛选相邻的重叠序列克隆 多此重复前步骤，直至克隆出目的基因 目的基因克隆第48页/共53页第49页/共53页 R B R R B B R R B B R E.coRI(R)部分酶切 分离长 100200kb 的 DNA 片段 R B R R B B R R 克隆到无BamHI切点的粘粒中 粘粒 cos R R R B