探讨酶解法提取荞麦皮中活性物质

1、.探讨酶解法提取荞麦皮中活性物质1引言苦荞,学名称鞑靼荞麦,是我国特有的一种土生植物,具有很强的环境适应能力，即使是恶劣的气候条件，也能顽强生存。苦荞麦生长在环境原始的高山寒冷地区,含有丰富的全面的氨基酸、油酸、亚油酸及多种维生素和活性物质等。苦荞麦是药物作用较强的植物,荞麦面具有杀肠道病菌、消积化痰、解除病毒的功效。苦荞富含比其他谷物高的生物类黄酮物质,是优质的保健食品来源之一。芦丁是黄酮类活性物质的主要成分之一,现代临床医学表明,苦荞麦及其制品可以帮助扩张冠状血管和降低血管脆性、降血糖、增强人体免疫功能,同时，在降低胆固醇及血脂方面有较好的效果,这与其含有黄酮类物质芦丁有很大的关系。对苦荞

2、麦中各部分黄酮得率进行深入研究,为苦荞麦资源的开发和保健食品的发展打了根基,也为评价苦荞麦各部分的功效价值提供了有效依据。近年来，伴随具各种生物活性的短肽的开发和研究，其研究和价值日益受到各国科学家的关注。大量科学研究显示通过选择合适的蛋白酶，水解的蛋白质可以得到大量的具有有益生物活性功能的生物活性肽。苦荞麦活性肽是苦荞麦皮粉经蛋白酶水解后产生的多肽和氨基酸的混合物质，在人体消化吸收方面有着更加令人满意的效果。近年国内外科研人员不断发现由苦荞麦粉水解制得的水解产物具有降低血液胆固醇、降血压、抑制有害物的吸收、抑制乳腺癌和大肠癌的发生、抑制脂肪蓄积、抑制胆结石的形成、抗氧化以及抗衰老等功能2。因

3、此，人们对苦荞麦研究和开发的不断深入，它的营养价值和生理功能会引起人们的关注，也会不断提升对苦荞麦活性物质的科学技术和钻研水平。1.1生物活性肽的概述肽(peptides)是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,是蛋白质的结构与功能片段,也正是因为他，蛋白质才会给人类带来数以千万计的生理功能。肽本身也具有很强的生物活性。氨基酸为肽的基本构成单位,由2个或3个氨基酸脱水缩合而成的肽分别叫二肽和三肽,以此类推为四肽、五肽。一般说来,肽链上氨基酸数目在10个以内的叫寡肽,1050个的叫多肽,50个以上的叫蛋白质。人们习惯上也把寡肽中的二、三肽称为小肽。因为构成肽的氨基酸种类、数目与排列顺序的不

4、同,所以肽具有了纷繁复杂的结构与功能。生物活性肽(biologicallyactivepeptide/bioactivepeptide/biopeptide)是指对生物机体的生命活动有益4或具有生理作用的肽类化合物,又称功能肽(functionalpeptide)。肽是由氨基酸组成,人体拥有20种氨基酸,由于不同的氨基酸的种类排列,以及数量排列，还可能有二级、三级结构,通过这种方式排列出来的肽，其类别庞大而复杂。每一种活性肽都是由其独特方式的组成,不同活性肽的组成结构决定了其具有复杂多样的功能。此外活性肽在生物体内的含量也很微量,但却显示了其卓越的生理活性。据报道,有些多肽在10-7mol/L

5、的浓度时，仍显示了其显著的生理活性,简单来说，1mL的多肽用60倍水稀释后,仍然可以发挥他的生理功能。而且生物体可以参考自身生理状态的情况下来合成或者降解其活性肽,因此,可以依据自身情况调节状态的活性肽的半衰期均很短。1975年Hughes等首先报道从动物组织中发现了具有类吗啡活性的小肽;1979年Brantl等从酶解的酪蛋白水解产物中分离到1个七肽物质(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile),为-酪蛋白的第6066氨基酸残基片段,具有阿片活性。阿片样肽(opioidpeptide)显示出类阿片受体配体活性,拥有激素和神经递质与体内的受体相互作用,具有镇痛和调节人体情绪、呼吸

6、、脉搏、体温的功能。内源性阿片肽有脑啡肽、内啡肽、强啡肽、孤啡肽。目前已经从小麦谷蛋白和大米蛋白中分离出了外源性阿片样肽。它们与普通镇痛剂的不同，经过消化道进入人体后没有任何副作用,也不会让人成瘾,这一方面已经上升为药理学、功能食品学研究的热点。至今，学者们已经从动、植物和微生物中分离提取出了众多纷繁复杂的生物活性肽。生物活性肽的结构有简单的二肽，也有较大分子的多肽(数百个氨基酸)。生物活性肽的生物学意义在于两个方面，一是其吸收机制优于氨基酸，二是具有氨基酸不可比拟的生理功能,其生理功能主要体现为有类吗啡样活性、激素和调节激素的功能,对生物体内的酶具有调节和抑制作用,免疫调节,抗血栓,抗高血压

7、,降低胆固醇,抑制细菌、病毒滋生,抗癌,抗氧化和清除自由基等作用,促进元素吸收和矿物质运输,调节生长,改善食品风味、口味和硬度等。因此,生物活性肽是筛选药物、制备疫苗、食品添加剂和功能性因子的天然资源宝库。1.2生物活性肽的研究历史所有的生物，从最简单的病毒直到复杂生物人类，体内庞大的蛋白质结构，本质上都由相同的20种氨基酸组成，也就构成了千姿百态的蛋白质世界。生物学家等在对蛋白质的深入研究过程中，发现一类由氨基酸构成但又不同于蛋白质的中间物质，这类具有蛋白质特性的物质被称作多肽。肽是比蛋白质简单、分子量小,由氨基酸通过肽键相连的一类化合物。多肽可以调理机体生理功能、为机体运输营养，它几乎影响

8、着人体的一切代谢合成。含有的氨基酸少于10个的肽称为寡肽，超过的就称为多肽；氨基酸为50多个以上的肽就成为人们熟悉的蛋白质。1902年，伦敦大学医学院的两位生理学家Bayliss和Starling在动物胃肠里发现了胰泌素，一种能刺激胰液分泌的物质。这是人类第一次发现的多肽物质。由于这一发现开创了多肽在内分泌学中的功能性研究，具有深刻的意义，诺贝尔奖委员会授予他们诺贝尔生理学奖。1931年，一种命名为P物质的多肽被发现，它具有兴奋平滑肌并能舒张血管而降低血压的作用。科学家们自此开始关注多肽类物质对神经系统的作用，并把这类物质命名为神经肽。1953年，由Vigneand领导的生化小组第一次成功合成

9、了生物活性肽催产素。从此，整个50年代的多肽研究，都集中于脑垂体所分泌的多种多肽激素。1952年，生物化学家StanleyCohen在将肉瘤植入小鼠胚胎的实验中，发现了小鼠交感神经纤维生长加快、神经节明显增大这一问题。8年后到了1960年，我们才知道这是因为一种多肽发挥的作用，并将之称为神经生长因子（NGF）。50年代末，Merrifield研究出了多肽固相合成的方法，因此被授予诺贝尔化学奖。60年代初期，多肽的研究得到了迅猛的发展，多肽的结构分析、生理功能等都得到了很多理论和实践成效6。1965年，我国科学家成功地合成了牛结晶胰岛素，这在世界范围里第一次人工合成多肽类生物活性物质。70年代，

10、神经肽的研究被推向了顶峰，脑啡肽及阿片样肽相继被公布，科学界进入了多肽影响生物胚胎发育的研究阶段。1975年Hughes和Kosterlitz从人和动物的神经组织中提取出内源性活性肽，增加了生物制药内容，拓展了“细胞生长调节因子”这一生物制药领域。这一时发现的细胞生长调节因子有100种,比临床应用的多肽激素和其他活性多肽的总和还要多很多。90年代，人类基因组计划开始全面启动。随着科学家们解开一个个基因的原理，多肽研究及其应用呈现空前繁荣的局面。肽是组成蛋白质的结构片段，蛋白质发挥作用也是依靠他所具有的活性基因部分。实际上动物体内的功能性蛋白质多数只是活性功能物质的载体，它们所具有的的功能多数只

11、是由挂在其上的肽段来实现的。通过多肽这一中介，既能够深入研究蛋白质的功能性质，又能为改善和组成新功能的蛋白质补充新的基础资源。同时，几乎所有细胞都由多肽调节，它包括激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域，在生命活动中，很多功能性生理作用如细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等，均与活性多肽息息相关。伴随现代生物技术的发展以及生命科学历程的演进，多肽在生物体内的生理功能被越来越多的人熟知，尤其是许多活性肽生理功能和结构的推进，更是增进了科学界对活性肽的重视和开发。1.3生物活性肽的生理功能1.3.1免疫活性Jolles等在酪蛋白的降解物中分离提取出了免疫活性肽,他能激发巨噬细胞的吞噬功能

12、。Berthou等对人乳酪蛋白的消化物进行研究，并提取得到六肽和三肽,并证明它能借助鼠巨噬细胞激活绵羊红血细胞的吞噬功能。提供免疫活性肽的食物源有大豆蛋白。这些免疫活性肽常常与肠粘膜结合淋巴组织形成战略伙伴,而且通过自由渗透肠壁而直接与外周淋巴细胞发生作用。胸腺肽可以化身免疫因子，寄身于载体上应用于医学，已经取得获得可喜成果。1.3.2抗氧化作用抗氧化肽存在于动物肌肉中的肌肽,可在体外抑制被铁、血红蛋白、脂质氧化酶和单态氧催化的脂质氧化作用3。某些肽和蛋白水解物承担着重金属清道夫作用和过氧化氢分解促进剂的作用,因而可降低自氧化速率和减少脂肪过氧化氢含量。抗氧化活性肽被添加到肉制品中，可以有效防

13、止氧化型脂肪酸败,扮演者防腐剂的角色，在食品和动物饲料中有无限的应用潜力。1.3.3抗高血压活性抗高血压肽主要是通过抑制血管紧张素-转换酶,进而影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统来实现对血压影响的。一般我们觉得,维持高活性必须有抗高血压肽的C末端的Pro、Phe和Tyr或序列中含有的疏水氨基酸。对二肽来说,最有效的方法是结合N未端的芳香氨基酸与血管紧张素。已知的抗高血压肽大致上有4种来源:如乳蛋白的肽类;来自酸乳的肽类;来自鱼贝类(沙丁鱼、金枪鱼)的肽类;来自植物的肽类(玉米醇溶蛋白、无花果)等。1.3.4降胆固醇作用研究发现,大豆多肽可以带来降低血清胆固醇的作用5,与大豆蛋白相比存在特殊的优点

14、。对于胆固醇值正常的人,没有降低胆固醇的作用,而对于胆固醇值高的人具有降低胆固醇的作用;对胆固醇值正常的人,食用高胆固醇含量的食品时,有预防血清胆固醇值升高的作用;使胆固醇中LDL、VLDL值降低,但不会使HDL值降低。大豆多肽主要是通过刺激甲状腺激素分泌来实现降胆固醇作用,促进胆固醇的胆汁酸化,使粪便排泄胆固醇增加,从而降低血液胆固醇。1.3.5促生长作用促生长肽能促进细胞的生长分化,如大豆蛋白的酶解物可刺激细菌的生长,特别是乳酸菌族的生长;从鸡蛋中提取的肽能促进细胞的生长和DNA的合成;动物循环中存在外源组织蛋白合成促进肽。1.3.6抗血栓作用研究人员从北美水蛭中发现一种由39个氨基酸残基

15、组成的肽,可竞争性地抑制纤维蛋白原与血小板表面的受体(GPb)与a结合,从而具有抗血小板聚集的功能和阻断血栓的最终生成。Jolles等发现,源于牛-酪蛋白的CasoplatelinC11肽可抑制腺苷酸二磷酸诱导的血小板凝集及其与纤维蛋白原结合的作用。抗血栓肽的发现和进一步的开发利用将为血栓类疾病的预防和治疗提供了新的手段。1.3.7抑制肿瘤转移某些小肽(如Arg-Gly-Asp、Leu-Asp-Val、Tyr-Ile-Sly-Ser-Arg)在肿瘤转移中起重要作用,人工合成含有这些氨基酸序列的外源性生物活性肽可以与细胞外基质(ECM)、纤维蛋白竞争细胞和血小板表面的整合素等分子,干扰肿瘤细胞-

16、ECM的相互作用,抑制血小板瘤栓形成及肿瘤血管生成,达到抑制肿瘤转移的目的。1.3.8抗衰老作用张政等采用碱抽提和等电点沉淀法从苦荞麦皮籽粒中制备出荞麦蛋白复合物，用20%苦荞麦蛋白复合物饲喂小鼠，结果发现小鼠血液和脏器中的超氧化物歧化酶、过氧化酶和谷胱苷肽过氧化物酶活性均有不同程度的提高，脂质过氧化物丙二醛含量下降，表明苦荞麦蛋白复合物对生物体有一定的营养和抗衰老作用7。1.4苦荞麦活性物质的研究目的与前景1.4.1苦荞麦活性物质的研究目的荞麦作为健康食品资源，正在被人们越来越熟悉和接受，并在世界范围内流行开来8，主要原因在于荞麦内含高生物价的蛋白质和丰富的生物活性物质。近几年的研究表明，多

17、酚类化合物是荞麦中最重要的营养保健功能因子。芦丁作为主要的黄酮类化合物22，报道最多。具有强化毛细血管，降血压，预防脑中风等生理功能。本试验旨在尽可能得到用碱性蛋白酶的水解下得到高含量的活性物质，找到最适合的水解条件，为苦荞麦的进一步研究提供试验方法与基础。1.4.2苦荞麦活性物质的研究前景苦荞麦活性肽的研究极具实际意义18：苦荞麦作为一种经济作物来源丰富、价格低廉，可满足大规模生产的需求；自原始社会以来，人们就有食用荞麦制品的习惯，开发生产荞麦活性肽易为人们所接受；苦荞麦活性肽产品安全健康，可靠养生，可以作为日常保健食品每天食用；开发具有抗氧化性的苦荞麦活性肽可以大幅度提高荞麦制品的附加值，

18、拓宽荞麦的用途；值得注意的是，目前苦荞麦的研究大多是以有机溶剂抽提为基础的，由苦荞麦粉经酶水解制得的活性物质的研究还极少有报道。因此开发利用苦荞麦蛋白质的生物功能，多渠道、多方位地开辟荞麦市场，研究开发苦荞麦活性物质必将具有广阔的前景。2.实验方法2.1实验材料、化学试剂与仪器2.1.1实验材料荞麦皮粉：取产自陕西的苦荞麦皮磨成粉并过60目筛；经半微量凯氏定氮法测定其蛋白质含量为2.39%。碱性水解蛋白酶（Alcalase）：购自诺维信中国生物技术有限公司2.1.2主要仪器名称型号产地1)紫外分光光度计UV-1601日本岛津公司2)电子天平AE-200上海梅特勒-托利多仪器有限公司3)电热恒温

19、水浴锅DK-S12上海森信实验仪器有限公司4)离心沉淀机80-2上海手术器械厂5）电炉6）半微量凯氏定氮仪一套7）25ml酸式滴定管（附滴定台）2.1.3化学试剂氢氧化钠、柠檬酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、盐酸、碳酸钠、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、L-酪氨酸（Tyr）、Folin-酚（以上所用试剂均为分析纯）。2.2酶解法提取荞麦皮中的生物活性肽2.2.1酶解步骤荞麦皮粉溶解热变性处理(80恒温水浴，30min)1mol/LNaOH调pH约11酶解灭酶(沸水浴10min)1mol/L柠檬酸调pH至4.5离心(3000rpm/25min)取上清液(提取液)2.2.2酶解反应的正交试验设计在探

20、索试验结果的基础上得到适合碱性水解蛋白酶酶解反应的相关参数，然后在此基础上对苦荞麦皮粉酶解反应的正交实验进行设计。实验因素分别是水解温度(A)、酶量g(B)和反应时间h(C)为条件，进行黄酮含量的三因素三水平的正交实验10。详见表1。2.3蛋白酶酶活测定酶活力单位定义为在特定的实验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量定义为一个酶活单位。2.3.1Tyr标准曲线的制作精确称取预先于105干燥至恒重的L-酪氨酸(Tyr)0.0lg，精确至0.00lg，用0.5mol/L的盐酸溶解后定容至l00mL，即为100g/mL酪氨酸标准溶液。然后配置成0、20、40、60、80、100g/mL(须做

21、平行试验)，向各试管依次中加入标准Tyr溶液、蒸馏水、碳酸钠溶液、Folin-酚试剂(详见表2)，迅速混匀后置予40水浴中显色15min，取出冷却至室温，在波长680nmI处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。2.3.2蛋白酶酶活测定精确称取待测碱性水解蛋白酶1.0g(样品需做3支平行试管)，用0.02mol/L磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲溶液(pH7.5)稀释2000倍。取lmL分别置于试管中(同时做空白对照，空白管立即加入10的三氯乙酸溶液3.0mL充分混匀)。另三管加入经37预热的pH7.8的1酪蛋白溶液2.0mL，混匀，连同空白管迅速放入37的恒温水浴锅中，用秒表

22、准确计时精确反应15min，立即向三个样品管加入10三氯乙酸溶液3.0mL，充分混匀；同时向空白管加入1的酪蛋白溶液2.0mL摇匀，然后将四管继续在40水浴中保温15min。最后通过离心除去来被水解的酪蛋白和酶蛋白，上清液分别取lmL放入三支干燥试管中。加入0.55mol/L碳酸钠溶液5.00mL，其余同标准曲线。在680nm波长比色测定12。2.3.3蛋白酶酶活的计算酶活力=A/(t×W)×K×V×N式中K：A=1.00时所需的酪氨酸的重量本实验K=168.78；W：酶的重量(w=1.0g，精确到0.001g)；V：水解酪蛋白混合物体积(v=6.0mL

23、)；t：时间(t=15min)；2.4苦荞麦皮中生物活性肽提取率的测定(以蛋白质含量记，半微量凯氏定氮法)2.4.1.蛋白质含量测定的实验原理样品与浓硫酸共热时，有机物被破坏，其中的碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而氮转变为氨再与硫酸结合成硫酸铵留在消化液中。硫酸铵用氢氧化钠中和生成氢氧化铵，加热又分解成氨，经硼酸吸收后用标准酸液滴定，根据标准酸液的消耗量计算总氮量，再乘以换算系数，即蛋白质含量。其反应式如下：H2SO4=SO2+H2O+O2CH3CHNH3COOH+12O6CO2+4H2O+2NH32NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NAOH=2NH3+NA2SO4

24、+2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCL+5H2O2NH4CL+4H3BO32.4.2苦荞麦皮酶解液中蛋白质含量的测定步骤吸取同一实验条件下的三组平行实验酶解液各5mL，于同一干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，8g硫酸钾及25mL硫酸，摇匀后先进行样品消化，待样品消化完成后，进行凯氏定氮，做三次平行测定。按同一方法作试剂空白试验。2.4.3结果计算公式蛋白质含量的计算公式X=(V1-V2)×C×0.014×F×100/m×（10/100）式中：X-样品中蛋白质的含量，%；V1-样

25、品中消耗盐酸标准液的体积，%；V2-试剂空白消耗盐酸标准液的体积，%；C-盐酸标准液的浓度，mol/L；0.014-1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的g数；F-荞麦皮为5.83；m-样品的质量，g或mL；2.4.4苦荞麦皮总蛋白质的含量测定称取固体样品2g于干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，8g硫酸钾及25mL硫酸，摇匀后先进行样品消化，待样品消化完成后，进行凯氏定氮。2.4.5苦荞麦皮抗氧化活性肽提取率的结果计算提取率（%）=苦荞麦皮提取液中总蛋白/苦荞麦皮总蛋白×100%2.5荞麦皮中黄酮得率的测定2.5.1黄酮得率测定的实验原理在黄酮类化合物的紫外光谱图上主要有

26、两个吸收带:环肉桂酰系统引起的吸收带(300550nm)和环苯酰系统引起的吸收带(240280nm)。若加入铝盐,则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物,带会明显向长波方向移动(红移)，在NaNO2的强碱性溶液中,其在510nm处吸光度值最大,从而为分光光度法测定提供了可靠的依据。黄酮13含量单位定义为在特定的实验条件下，每克苦荞麦皮中所含的黄酮的毫克数。2.5.2芦丁标准曲线的绘制14准确称取干燥恒重的芦丁标准品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，摇匀得浓度为0.3000mg/mL标准应用液。吸取芦丁标准液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL置于0#

27、、1#、2#、3#、4#、5#、6#25mL容量瓶中，用30%乙醇补充至12.5mL，分别加0.7mL5%亚硝酸钠溶液摇匀，放置5min后分别加入0.7mL10%硝酸铝摇匀，6min后分别加入5mL1mol/L氢氧化钠摇匀，用30%乙醇定容至刻度，10min后于510nm处比色测定，0#作参比得黄酮含量测定的标准曲线，以浓度（C）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标得标准曲线方程：A=0.0104C+0.0062R2=0.9999A-吸光度C-ug/mL即C=95.853A-0.5905R2=0.99992.5.3分光光度法测定黄酮吸光度取0.5mL样品于25mL容量瓶中，用30%乙醇补充至12.

28、5mL，加入0.7mL亚硝酸钠摇匀静置5min，加入0.7mL硝酸铝摇匀静置6min，加氢氧化钠5mL,30%乙醇定容至25mL.10min后测定其在510nm下比色测定，用无样品的同样的混合液作空白参比，测定吸光度A15-17。2.5.4黄酮得率计算苦荞麦皮中黄酮得率（%）为C*25/0.5*100mL*10-6g/10g式中：C为由测定出的吸光度值根据芦丁标准曲线算出黄铜浓度单位ug/mL3.结果与讨论3.1标准曲线的绘制3.1.1酪氨酸标准曲线绘制分别配制酪氨酸系列浓度20µg/mL、40µg/mL、60µg/mL、80µg/mL、100µ

29、;g/mL，测量其对应的吸光度值结果如表2。表2酪氨酸标准曲线绘制Table2tyrosinestandardcurvedrawing浓度C（µg/mL）20406080100吸光度A0.1220.2410.3580.4770.594标准曲线方程为：Y=0.0059x+0.0044R2=1.0000。3.1.2蛋白酶酶活测定采用Folin-酚法测定碱性水解蛋白酶的平均吸光度值为0.124，代入计算公式，测得碱性水解蛋白酶的酶活为1.6743×104（U/g）。3.1.3芦丁标准曲线绘制准确称取干燥恒重的芦丁标准品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，摇匀得浓度为

30、0.3000mg/mL标准应用液。分别系列的芦丁溶液，测量其对应的吸光度值，结果如表3。表3芦丁标准曲线绘制Table.3Therutinstandardcurvedrawn芦丁标准液（mL）01.02.04.06.08.0吸光度（A）空白0.1350.2590.5080.7601.0043.2苦荞麦皮酶解提取活性肽和黄酮的正交实验结果与极差分析按2.2.2苦荞麦皮酶解反应的正交试验表进行正交试验，对其活性肽提取率()进行测定，如表四所示。表4荞麦酶解反应的正交试验结果Table.4Buckwheatenzymaticreactionoforthogonaltestresults样品号因素活性

31、肽提取率(%)黄酮得率(%)ABC111142.20±1.283.40±0.01212230.50±5.442.69±0.01313338.86±1.283.43±0.00421236.36±0.663.51±0.04522333.84±0.263.16±0.04623133.44±5.023.12±0.15731328.42±2.042.84±0.10832133.44±1.383.24±0.14933245.96±3.183.40±0.01从表4中可以看出，10g苦荞麦皮粉用碱性蛋白酶水解提取黄酮，黄酮的得率为3.00%左右，根据文献，10g苦荞麦皮粉用乙醇抽提所得的最高黄酮得率为1.80%，可见，苦荞麦皮中的黄酮用碱性蛋白酶酶解提取要比用乙醇抽提效果好，碱性酶酶解提取黄酮切实可行。为了了解各因素对活性肽提取率和黄酮得率()，本文做了极差分析，如表五