固定化酶和固定化细胞ppt课件

1、主要内容：主要内容： 1 固定化酶的定义与优点固定化酶的定义与优点 2 酶固定化技术开展史酶固定化技术开展史 3 固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法 4 固定化酶的特性固定化酶的特性 5 固定化活细胞固定化活细胞 6 酶催化反响器及其类型酶催化反响器及其类型游离酶的运用游离酶的运用蒸汽酶解罐简易图加热灭酶酶无法回收稳定性差1 固定化酶的定义与优点固定化酶的定义与优点v所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和延续运用的酶。固定化酶的优点：固定化酶的优点：1同一批固定化酶能在工艺流程中反复多次地运用；2固定化后，和反响物分开，有利于控制消

2、费过程，同时也省去了热处置使酶失活的步骤；3稳定性显著提高；4可长期运用，并可预测衰变的速度；5提供了研讨酶动力学的良好模型。2 酶固定化技术开展史 起始研讨起始研讨1916年年系统研讨系统研讨1950年年-工业化运用工业化运用1969年年-1916年，Nelson和Griffin将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，吸附以后酶不溶于水且具有和液体酶同样的活性，实现了酶的固定化，惋惜长期未得到注重。1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化酶。60年代后期，酶固定化技术迅速开展，出现了很多新的酶固定化方法。1969年，千畑一郎等将固定化

3、氨基酰化酶运用于DL-氨基酸的光学拆分上，来消费L-氨基酸，开创了固定化酶运用于工业消费的先例。 1973年，将固定化微生物细胞初次运用于工业消费。v 目前，固定化技术曾经获得了许多重要成果，充分发扬了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低本钱方面的宏大潜力。v 但从目前的开展情况来看，虽然酶种类繁多，但曾经固定化的酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模消费的企业尚属少数，真正在工业上运用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研讨开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模消费。运用现状：运用现状：3 固定化酶的制备方法v酶的固定化方法主要可分为

4、四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法。v对于特定的目的酶，要根据酶本身的性质、运用目的、运用环境来选择固定化载体和方法。在详细选择时，普通应遵照以下在详细选择时，普通应遵照以下6个原那么。个原那么。 v 1酶与载体的结合部位不该当是酶的活性部位，固定化时应采取尽能够温暖的条件。v 2酶与载体必需有一定的结合程度，利于反复运用。v 3用于固定化的载体必需有一定的机械强度，不易破坏或受损。v 4固定化应尽能够不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。v 5所选载体应不和底物、产物或反响液发生化学反响。v 6固定化酶的本钱适中，以利于工业运用。3.1吸附法v吸附法是经过载体外表和酶分子外

5、表间的次级键相互作用而到达固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。v酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。v吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。 v 物理吸附法是经过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体外表上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法。v 常用的载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋、活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。v 优点：操作简单、价廉、条件温暖，载体可反复运用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，固定化酶活力较高。v 缺陷：酶和载体结合不结实，在运用过程中容易零落，常与交联法结合运用。1物理吸附法物理吸附法v离子

6、吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即经过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。vDEAE-纤维素吸附的-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 v具有操作简便、条件温暖、酶活力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。2离子吸附法离子吸附法3.2包埋法v包埋法是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。1凝胶包埋法凝胶包埋法 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚

7、乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。 1-2%1-2%海藻酸钠海藻酸钠+ +酶液酶液EEEE5%CaCl25%CaCl2溶液溶液2微胶囊包埋法微胶囊包埋法 v微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。v它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的零落，防止微囊外的环境直接接触，从而添加了酶的稳定性。v常用于制造微胶囊的资料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。 v适宜于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。3.3共价键结合法v共价键结合法(covalent binding是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶蛋白上可供载体结合的功能基团有

8、以下几种：v1酶蛋白N末端的-氨基或赖氨酸残基的-氨基。2酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。3半胱氨酸残基的巯基。4丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。5组氨酸残基的咪唑基。6色氨酸残基的吲哚基。7苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。v其中最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研讨中最活泼的一大类方法，v但必需留意，参与共价结合的氨基酸残基该当是酶催化活性非必需基团，如假设共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。v 用共价键结合法制备的固定化酶，酶和载体之间都是经

9、过化学反响以共价键偶联。由于共价键的键能高，酶和载体之间的结合相当结实，即使用高浓度底物溶液或盐溶液，也不会使酶分子从载体上零落下来，具有酶稳定性好、可延续运用较长时间的优点。 v 但是采用该方法时，载体活化的难度较大，操作复杂，反响条件较猛烈，制备过程中酶直接参与化学反响，易引起酶蛋白空间构象变化，酶活回收率普通为30%左右，甚至酶的底物的专注性等性质也会发生变化，往往需求严厉控制操作条件才干获得活力较高的固定化酶。 3.4交联法v 交联法交联法cross-linking是运用双功能或多功能试剂使酶是运用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状构造的固定化方法。分子之间相互交联呈网状构造

10、的固定化方法。v 由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基等参与反响，所由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基等参与反响，所以酶的活性中心构造能够遭到影响，使酶明显失活。以酶的活性中心构造能够遭到影响，使酶明显失活。v 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和氮联苯和N,N-乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中运用最广泛乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中运用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反响，反响，构成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联构成固定化酶。构成薛夫碱，从而使酶

11、分子之间相互交联构成固定化酶。以上四种固定化酶方法各有其优缺陷见表以上四种固定化酶方法各有其优缺陷见表4-1。往往一种酶可以用。往往一种酶可以用不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。不同方法固定化，但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶。在实践运用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。在实践运用时，常将两种或数种固定化方法并用，以取长补短。4 固定化酶的特性4.1固定化酶的外形v固定化酶的方式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等外形。v其中颗粒占绝大多数，它和线条主要用于工业发酵消费，如装成酶柱用于延续消费，或在反响器中进展批式搅拌反响；v薄膜主要用

12、于酶电极，运用于分析化学；v酶管机械强度较大，亦宜用于工业消费。4.2酶活力v固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其缘由能够是：v酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；v当酶与载体结合时，它的高级构造发生了变化；v酶与底物间的相互作用遭到空间位阻的影响。v也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，能够是由于固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游离酶活力高。4.3固定化酶的稳定性 普通情况下，半衰期在一个月以上，即有工业运用价值。大多数酶在固定化后，热稳定性提高，但有些酶采用吸附法固定化时会降低。可延伸酶的贮藏有效期。假设贮藏条件比较好，亦可较长时间坚持活力。由于酶固定化后遭到

13、空间位阻的影响，蛋白酶不能有效接触，因此抵抗力提高。多数固定化酶的酸碱稳定性提高。极少数酶固定化后由于酶活性构象的敏感区遭到牵连导致稳定性下降。4.4固定化酶的反响特性v 固定化酶的反响特性，例如，底物特异性、酶反响的最适pH、酶反响的最适温度、动力学常数、最大反响速度等均与游离酶有所不同。1底物特异性底物特异性v 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系。普通来说，当酶的底物为小分子化合物时，固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化。v 而当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶等，普通随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。v 这是由于载体引起的空间位阻作用，

14、使大分子底物难以与酶分子接近而无法进展催化反响，酶的催化活力难以发扬出来，催化活性大大下降。v 例如，糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时，对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77，而对分子量为50万的直链淀粉的活性只需15%17。2反响的最适反响的最适pHv酶被固定后，其最适pH和pH曲线常会发生偏移。v普通来说，产物为酸性时，固定化酶的最适pH与游离酶相比升高；产物为碱性时，固定化酶的最适pH与游离酶相比降低。3反响的最适温度反响的最适温度 v 固定化酶的最适反响温度多数较游离酶高。v如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高515，但也有不变甚至降低的。固定化酶的作用最适温度会受固定化

15、方法以及固定化载体的影响。 4米氏常数米氏常数v酶经固定化后，酶蛋白分子的高级构造的变化以及载体电荷的影响可导致底物和酶的亲合力的变化。v运用载体结合法制成的固定化酶Km有时变动的缘由，主要是由于载体与底物间的静电相互作用的缘故。5最大反响速度最大反响速度 固定化酶的最大反响速度与游离酶大多数是一样的。有些酶的最大反响速度会因固定化方法的不同而有所差别。5 固定化活细胞v 20世纪70年代，在固定化酶的根底上科学家们研制成固定化细胞Immobilized Cell，并且用于消费。v 直接固定那些含有所需胞内酶的细胞，并且利用这样的细胞来催化化学反响。v 70年代末，法国研讨胜利固定化细胞消费啤

16、酒，80年代初我国居乃琥等用固定化细胞批量消费啤酒和酒精获得重要研讨成果。 v 固定化细胞按其生理形状又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。固定化细胞的优点和缺陷：固定化细胞的优点和缺陷：固定化活细胞优点缺陷必需坚持菌体的完好，防止菌体的自溶，否那么影响产物的纯度；必需抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；胞内多酶的存在，会构成副产物；载体、细胞膜或细胞壁会呵斥底物浸透与分散的妨碍等。无需进展酶的分别和纯化，减少酶活损失，降低本钱； 可进展多酶反响，且不需添加辅助因子；活细胞坚持了酶的原始形状，稳定性更高，对污染的抵抗力更强；细胞生长停滞时间短，细胞多，反响快等等。物理吸附法物理吸附法包埋法包埋法 6

17、 酶催化反响器及其类型以酶为催化剂进展反响所需求的设备称之为酶催化反响器，简称酶反响器。6.1酶反响器的类型v 酶反响器有两种类型：v 一类是直接用游离酶进展反响，即均相酶反响器；v 另一类是运用固定化酶进展的非均相酶反响器。v 均相酶反响能在批量式搅拌桶反响器或超滤膜反响器中进展，而非均相酶反响那么可在多种反响器中进展，适用于延续催化反响，包括：延续流搅拌桶反响器、填充床反响器、流化床反响器、延续搅拌桶-超滤和循环式反响器等。 6.2反响器的构造特点反响器的构造特点 v 这类反响器构造简单，造价较低，传质阻力很小，反响能迅速到达稳态，主要运用在饮料等食品工业中。v 其缺陷是操作费事，在反复回

18、收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。但是，常用于游离酶。图图4-2 批量式搅拌桶反响器批量式搅拌桶反响器6.2.1 批量式搅拌桶反响器v 这种反响器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反响器，与此同时，反响液那么以同样的流速流出反响器。反响桶内装有搅拌器，使反响组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新颖底物与反响液流量维持动态平衡，如图4-3。 6.2.2 延续流搅拌桶反响器图图4-3 延续流搅拌桶反响器延续流搅拌桶反响器6.2.3 填充床反响器图4-4填充床反响器PBR具有高效率、易操作、构造简单等优点。它适用于各种外形的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大

19、的底物溶液，以及有产物抑制的转化反响。其缺陷是传质系数和传热系数相对较低。当底物溶液含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用目前工业消费及研讨中运用最为普遍的反响器。目前工业消费及研讨中运用最为普遍的反响器。6.2.4 流化床反响器图4-5 流化床反响器主要被用来处置一些粘度高的液体和颗粒细小的底物，如用于水解牛乳中的蛋白质。同时，亦可用于需求供气体或排放气体的酶反响即固、液、气三相反响。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反响。 6.2.5 延续搅拌桶-超滤反响器(CSTRUF)图4-6 延续搅拌桶-超滤反响器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。如：纤维素的延续

20、糖化、-淀粉酶水解淀粉6.2.6 循环反响器Recycle Reactor，RCR外循环反响器 内循环反响器 循环操作仍能为底物与酶提供足够的接循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触时机，以到达所需的转化率。这种反响器触时机，以到达所需的转化率。这种反响器可用于难溶或者不溶性底物的转化反响。可用于难溶或者不溶性底物的转化反响。 6.3膜式反响器膜式反响器v 膜式反响器是20世纪70年代以来开展起来的一种新型反响器，它是利用膜的分别功能，同时完成反响和分别过程的一种反响器。v 6.3.1膜式反响器的类型：v 根据酶的存在形状、相数、膜组件型式、膜资料类型、耦合方式、传质推进力等的不同，酶膜反响器有

21、不同的分类方式。根据膜组件的型式不同，可把酶膜反响器分为板框式、螺旋卷式、管式和中空纤维式酶膜反响器。以下以螺旋卷膜式反响器和中空纤维膜式反响器为例来阐明。1螺旋卷膜式反响器螺旋卷膜式反响器 v 此反响器的螺旋构造是将含酶的膜片与支持资料交替地缠绕在中心棒上。所用的膜片普通是胶原蛋白；而支持资料那么是一种称为凡克塞的惰性聚合网状物。v 把上述螺旋元件装进圆筒，筒两端加盖板，并安装进出口管，这样，就制成了螺旋卷膜式反响器。v 螺旋模型可将流体流动的单元分隔成许多独立空间，改善接触效果，消除短路；v 另外，网状支持资料可以提高每一流动间隔的混合效果，加快物质传送。2中空纤维膜式反响器中空纤维膜式反响器外层：中空纤维膜中空纤维膜 水和小分子产物多孔海绵状的支持层固定酶半透性膜大分子底物用这种固定化酶填充的反响器可以提供较大的催化外表，缺陷：中空纤维的制造极为困难，难以保证纤维束内流体流动的均匀性，以及存在较大的物质传送阻力等。6.3.2 膜式反响器的特点1膜的选择透过性使某些组分膜的选择透过性使某些组分(如产物如产物)延续脱除，使反响转化率不受延续脱除，使反响转化率不受化学平衡转化率的限制，提高了反响的转化率。化学平衡转化率的限制，提高了反响的转化率。2酶膜反响器可将目的产物分别出去，而酶可以反复利用，可实现延酶膜反响器可将目的产物分别出去，而酶可以反复利