兰州大学 第4章 蛋白质的共价结构

1、1第四章 蛋白质的共价结构一、蛋白质通论一、蛋白质的化学组成和分类一、蛋白质的化学组成和分类 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成：主要由C、H、O、N、S组成，其中含N平均为16%，这一数据可用于蛋白质的含量测定，是凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。 蛋白质含量=蛋白氮/16%=蛋白氮6.25蛋白质按化学组成分类蛋白质按化学组成分类 单纯蛋白质：单纯蛋白质：完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7类： 清蛋白（溶于水） 球蛋白（溶于稀盐溶液） 谷蛋白（溶于稀酸或稀碱） 醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇） 组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀） 精蛋白（溶于水或稀酸，

2、不溶于氨水） 硬蛋白（只能溶于强酸）。 （二）缀合蛋白（二）缀合蛋白 由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。 （三）按蛋白质的生物学功能分类（三）按蛋白质的生物学功能分类1酶 生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。2调节蛋白 某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质 。3转运蛋白 脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素

3、结合球蛋白结合才能在血液中运输。4贮存蛋白 某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。5收缩和游动蛋白 肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构像的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。 6结构蛋白 蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成

4、的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。7. 支架蛋白 这一类蛋白质主要起到支架作用，并且在这种蛋白上能完成某些蛋白的装配。如锚定蛋白就属于支架蛋白。8保护和开发蛋白 高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。9异常蛋白 除具有上述功能蛋白质以外的一类蛋白质。 二、蛋白质的形状和大小二、蛋白质的形状和大小 按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。 蛋白质的相对分子质量差别很大。

5、三、蛋白质构像和蛋白质结构的三、蛋白质构像和蛋白质结构的组织层次组织层次 蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次： 一级结构：多肽链的氨基酸序列。 二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如螺旋、折叠等。 三级结构：多肽链借助各种非共价键弯曲折叠具有特定走向的紧密球状构象。 四级结构：指寡聚蛋白质中个亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。四、蛋白质功能的多样性四、蛋白质功能的多样性 蛋白质序列的多样性(P160)决定了其功能的多样性。 如：20种蛋白质形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为： 20！=21018 。 又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假

6、定在肽链的任一位置，12种氨基酸出现的概率相等，则34000/120=283，12283 = 10305。 催化：大多数酶是蛋白质。 调节：如激素和反式作用因子。 转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜 转运蛋白等。 贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。 运动：如肌肉、微管蛋白等。 结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。 结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。 支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。 防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。 异常功能：如甜蛋白、胶质蛋白等。 12第二节肽一、肽和肽键的结构一、肽和肽键的结构 肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的 6个原子处于共平面，称作肽平面，肽平面内两个C多

7、处于反式构型。 二、肽的物理和化学性质二、肽的物理和化学性质 肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量。 肽的化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在，肽可以进行双缩脲反应。三、天然存在的活性肽三、天然存在的活性肽 均为9肽，仅2个氨基酸有差别，生理功能差别极大。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽 由细菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine，缩写为Orn）19第三节蛋白质一级结构的测定 一、蛋白质测序的策略一、蛋白质

8、测序的策略 确定蛋白质的纯度在97%以上。 测定多肽链的数目。 拆分多肽链。 分析每一条多肽链的氨基酸组成。 鉴定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基。 用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。 测定各肽段的氨基酸序列。 拼接各肽段成完整的多肽链。 确定二硫键的位置。二、二、N-末端和末端和C-末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定 （一）（一）N-末端的测定末端的测定 二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法)：2，4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以

9、用色谱法进行鉴定。O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸 丹磺酰氯法：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到110-9mol，比DNFB法灵敏100倍。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 异硫氰酸苯酯(PITC)法：N末端氨

10、基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的氨基酸序列测定。 氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。 （二）（二）C-末端的测定末端的测定 还原法：还原法：C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 肼解法：肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，可断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的

11、物质而与C-端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸 羧肽酶法：将蛋白质在pH 8.0，30与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A，B，C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro，Arg和Lys以外的所有C-末端氨基

12、酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。通常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。三、二硫桥的断裂三、二硫桥的断裂四、氨基酸组成的分析四、氨基酸组成的分析 一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，24小时即可完成。 蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。五、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化五、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 可以用酶水解法或化学水解法将蛋白质水解成肽段。 肽段的分离纯化可用层析法或电

13、泳法。 溴化氰断裂法：溴化氰断裂法： 羟胺断裂法：羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键。六、肽段氨基酸序列的测定六、肽段氨基酸序列的测定 （一）（一）Edman化学降解法化学降解法 用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54。 （二）降解法（二）降解法 可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。 （三）根据核苷酸序列推定法（三）根据核苷酸序列推定法 分离mRNA，经反转录测定cDNA的核

14、苷酸序列，再用遗传密码推定氨基酸序列。 （四）质谱法（四）质谱法 可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。 七、肽段在多肽链中次序的决定肽段七、肽段在多肽链中次序的决定肽段A A法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽： A A1 1 Ala-Phe Ala-Phe A A2 2 Gly-Lys-Asn-Tyr Gly-Lys-Asn-Tyr A A3 3 Arg-Tyr Arg-Tyr A A4 4 His-Val His

15、-ValB B法水解得到四个小肽：法水解得到四个小肽： B B1 1 Ala-Phe-Gly-Lys Ala-Phe-Gly-Lys B B2 2 Asn-Tyr-Arg Asn-Tyr-Arg B B3 3 Tyr Tyr- His-Val- His-Val重叠法：重叠法： Ala-Phe-Gly-LysAla-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgAsn-Tyr-ArgTyrTyr-His-Val-His-Val 八、二硫桥位置的确定八、二硫桥位置的确定用对角线电泳法： 九、蛋白质测序举例（胰岛素的序列测定）九、蛋白质测序举例（胰岛素的序列测定） 十、蛋白质序列数据库十、蛋白质序列数

16、据库 欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息。 美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。 美国政府支持的Gen Bank和欧洲的EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。第四节蛋白质的氨基酸序列与生物功能 一、同源蛋白质的物种差异与生物进化一、同源蛋白质的物种差异与生物进化细胞色素C的物种差异。 二、同源蛋白质具有共同的进化起源二、同源蛋白质具有共同的进化起源血红素蛋白与肌红蛋白 丝氨酸蛋白酶类:显示明显的序列同源性。 一些功能差异很大的蛋白质:如溶菌酶和-乳清蛋白功能差异很大，但有序列同源性。蛋白质家族的形成可能有趋同进化和趋异进化两种机制。 三、血液凝固与氨