第3章白质分离纯化ppt

1、第三章第三章蛋白质的分离纯化与表征蛋白质的分离纯化与表征蛋白质的分离纯化与表征 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 蛋白质胶体与沉淀蛋白质胶体与沉淀 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的方法蛋白质分离纯化的方法 蛋白质含量测定与纯度鉴定蛋白质含量测定与纯度鉴定第三章 蛋白质的分离纯化与表征蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋白质中可解离的基团蛋白质中可解离的基团 蛋白质的等电点蛋白质的等电点1蛋白质的酸碱性质蛋白质中可解离的基团蛋白质中可解离的基团-nh3+pka=7.68.4-coo-pka=33.2next page

2、1蛋白质的酸碱性质蛋白质中可解离的基团蛋白质中可解离的基团-coo-pka=3.04.7-coo-pka=4.41蛋白质的酸碱性质蛋白质中可解离的基团蛋白质中可解离的基团pka=5.67.0-nh2pka=9.410.61蛋白质的酸碱性质蛋白质中可解离的基团蛋白质中可解离的基团pka=11.612.6pka=9.810.4pka=9.110.81蛋白质的酸碱性质蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质 等电点 蛋白质 等电点胃蛋白酶 1.0 -胰凝乳蛋白酶 8.3卵清蛋白 4.6 -胰凝乳蛋白酶原 9.1血清清蛋白 4.7 核糖核酸酶 9.5-乳球蛋白 5.2 细胞色素c 10.7胰岛素 5.3 溶

3、菌酶 11.0血红蛋白 6.71蛋白质的酸碱性质蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 根据化学组成测相对分子量根据化学组成测相对分子量 渗透压法测相对分子量渗透压法测相对分子量 扩散系数法测相对分子量扩散系数法测相对分子量 沉降分析法测相对分子量沉降分析法测相对分子量 凝胶过滤法测相对分子量凝胶过滤法测相对分子量 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量2蛋白质的分子形状与大小根据化学组成测相对分子量根据化学组成测相对分子量 肌红蛋白（肌红蛋白（mb） m.w.=(fe原子量原子量)/(mb中中fe含量含量)*100 =55.8/0.335*100=16

4、 700 血红蛋白（血红蛋白（hb） 一分子中含有一分子中含有4个个fe原子，因此：原子，因此： mw=4*16700=66 8002蛋白质的分子形状与大小渗透压法测相对分子量渗透压法测相对分子量 =rt( + k*c2)cmr c=rtmr+ k*c c cmr =rtlimc0 cmr=10 000100 0002蛋白质的分子形状与大小扩散系数法测相对分子量扩散系数法测相对分子量 fick第一扩散定律：第一扩散定律： 扩散系数扩散系数d求法（求法（ fick第二扩散定律）第二扩散定律）dmdt= - d*a*dcdxdcdt= - dd2cdx2c2c1= exp(- )x22-x124d

5、t2蛋白质的分子形状与大小扩散系数法测相对分子量扩散系数法测相对分子量扩散系数扩散系数d随蛋白质随蛋白质mr的增加而降低。的增加而降低。蛋白质蛋白质 mr 扩散系数（扩散系数（107cm2s-1)核糖核酸酶核糖核酸酶a 12 600 11.9细胞色素细胞色素c 13 370 11.4肌红蛋白肌红蛋白 16 900 11.3凝乳蛋白酶原凝乳蛋白酶原 23 240 9.5血红蛋白血红蛋白 64 500 6.9过氧化氢酶过氧化氢酶 247 500 4.1肌球蛋白肌球蛋白 524 800 1.12蛋白质的分子形状与大小沉降分析法测相对分子量沉降分析法测相对分子量 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心蛋白质

6、分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉液的密度，蛋白质分子就会沉降。沉降速率与降速率与蛋白质分子的大小蛋白质分子的大小和和密度密度有有关，而且与关，而且与分子形状、溶液的密度和分子形状、溶液的密度和粘度粘度有关。有关。2蛋白质的分子形状与大小沉降分析法测相对分子量沉降分析法测相对分子量斯维得贝格方程：斯维得贝格方程：mr =rtsd(1-)s为沉降系数:单位秒-1，通常将10-13秒 作为一个单位用s表示为偏微比容：蛋白质溶于水为0.74cm3/g为溶剂的密度2蛋白质的分子形状与大小2蛋白质的分子形状与大小凝胶

7、过滤法测相对分子量凝胶过滤法测相对分子量洗脱液体积（ml）蛋白质含量相对分子量mrabcd待测蛋白分子量待测蛋白分子量2蛋白质的分子形状与大小sds-sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量凝胶电泳法测相对分子量 电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大电泳时的迁移率取决于蛋白的净电荷、分子大小、形状；小、形状； sds（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合，使全部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成部呈负电荷，同时改变蛋白质单体分子构象成近似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离；近似球形；巯基乙醇打开二硫键，使亚基分离； 电泳时蛋白质向正极移动。电泳时

8、蛋白质向正极移动。 分连续和不连续体系（圆盘电泳）分连续和不连续体系（圆盘电泳）2蛋白质的分子形状与大小sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量凝胶电泳法测相对分子量2蛋白质的分子形状与大小sds-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量凝胶电泳法测相对分子量abrf=a/b2蛋白质的分子形状与大小蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质胶体稳定性的三个要素： 质点大小1100nm；带相同电荷； 形成溶剂化层；稳定亲水性蛋白质胶体的因素： 水化层： 双电层：3蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀盐析法：nacl、(nh4)2so4有机溶剂沉淀：乙醇、丙酮重金属盐沉淀：hg2+、ag+生物碱

9、与某些酸类沉淀：单宁酸、tca加热变性沉淀： 3蛋白质的胶体性质蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加蛋白质含量与生物活性， 除去不必要的杂质蛋白；前处理：细胞破碎粗分级分离：盐析、等电点沉淀、有机 溶剂沉淀等细分级分离：层析、电泳、结晶 4蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法根据下列性质将蛋白分离纯化：分子大小溶解度电荷吸附性质对配体分子的亲和力 4蛋白质的分离纯化透析与超过滤透析与超过滤4蛋白质的分离纯化透析 通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（通常是将浓缩液装在一个用赛咯吩（cellophanecellophane）制造的透析袋内，两端都密封好，然后

10、将透析袋制造的透析袋内，两端都密封好，然后将透析袋悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。悬浮在一个装有很多缓冲液的容器内进行透析。因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不因为赛咯吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分能透过膜，仍然留在袋内，但蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯就可除去小分子（如硫酸铵）。经硫酸铵分级纯化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一化、透析的粗分级的蛋白质样品可以通过以下一些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定

11、。些常用的分离纯化技术和方法进一步纯化和鉴定。4蛋白质的分离纯化超 滤 超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大称多孔膜，根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂子溶液的浓缩，不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理分离方法。分离方法。4蛋白质的分离纯化超滤离心管切向流超滤器4蛋白质的分离纯化离心技术 离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备

12、，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 密度梯度离心技术是利用每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的密度梯度时即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4蛋白质的分离纯化差差速速离离心心differential centrifugation as a first step in protein purification4蛋白质的分离纯化密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心4蛋白质的分离纯化密度梯度（区

13、带）离心密度梯度（区带）离心4蛋白质的分离纯化凝胶过滤凝胶过滤 凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离凝胶过滤层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。纯化的。 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。 当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。取决于孔穴的大小和组分分子大小。 分

14、子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 4蛋白质的分离纯化凝胶过滤（分子排阻层析）凝胶过滤（分子排阻层析）基于分子大小4蛋白质的分离纯化利用溶解度差别的纯化等电点沉淀（等电点时静电荷为零，相邻蛋白质分子间没有静电斥力而趋于聚集沉淀）盐析与盐溶（中性盐可以增加蛋白质的溶解度，称为盐溶；盐析作用主要是大量中性盐争夺蛋白质疏水表面水分子）有机溶剂分级分离（有机溶剂降低蛋白质表

15、面可解离基团的离子化程度，促进蛋白质的聚集和沉淀）4蛋白质的分离纯化利用溶解度差别的纯化利用溶解度差别的纯化分级沉淀（盐或有机溶剂）4蛋白质的分离纯化利用电荷差别的纯化利用电荷差别的纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦离子交换层析层析聚焦4蛋白质的分离纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）平板电泳平板电泳4蛋白质的分离纯化聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）管状电泳图谱平板page图谱4蛋白质的分离纯化等电聚焦电泳等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化随所处环境酸碱度的变

16、化而变化 。在电场存在下的一定。在电场存在下的一定phph溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一分子将向正极移动，在某一phph时，蛋白分子在电场中不再时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的移动，此时的phph值即为该蛋白质的等电点。值即为该蛋白质的等电点。 等电聚焦等电聚焦(ief(ief）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极成从正极到负极phph逐渐增加的逐渐增加的phph梯度，处在其中的蛋白分梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等

17、电点的位置子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的上，测出蛋白分子聚焦位置的phph值，便可以得到它的等电值，便可以得到它的等电点。点。4蛋白质的分离纯化等电聚焦电泳等电聚焦电泳蛋白质在具有ph梯度的介质中电泳4蛋白质的分离纯化等电聚焦电泳等电聚焦电泳4蛋白质的分离纯化二维电泳 19751975年，年，o ofarrell farrell 首先运用双向电泳技术将首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出大肠杆菌总蛋白分离出11001100多个蛋白点。后来多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前

18、，随着蛋白组工程的发展，双向电分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。 二维电泳由第一向等电聚焦二维电泳由第一向等电聚焦(ief)(ief)电泳和第二电泳和第二向向sds-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)(sds-page)组成，组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。到高分辨率的蛋白图谱。4蛋白质的分离纯化二维电泳二维电泳isoelectric

19、 focusing is often combined with sds-page to generate two dimensional gels.4蛋白质的分离纯化二维电泳的应用示例4蛋白质的分离纯化离子交换层析离子交换层析阳离子交换剂： cm-纤维素：-o-ch2cooh p-纤维素：磷酸基阴离子交换剂： deae-纤维素：二乙基氨基乙基 ae-纤维素：氨基乙基4蛋白质的分离纯化离子交换层析离子交换层析4蛋白质的分离纯化4蛋白质的分离纯化亲和层析原理：原理：依赖于蛋白质和它的配体（依赖于蛋白质和它的配体（ligandligand）之间）之间的相互作用来分离。的相互作用来分离。配体配体通常

20、指的是能与另一通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配子、基团、离子或原子。但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶体是通过共价键先与基质结合。配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器靶蛋白的抗体，也可以是受体、核酸、细胞器等。等。亲和层析是分离效率最高的分离方法。亲和层析是分离效率最高的分离方法。4蛋白质的分离纯化亲和层析过程示意图（亲和层析过程示意图（1 1）4蛋白质的分离纯化亲和层析

21、过程示意图（亲和层析过程示意图（2 2）4蛋白质的分离纯化亲和层析过程示意图（亲和层析过程示意图（3 3）4蛋白质的分离纯化亲和层析过程示意图（亲和层析过程示意图（4 4）4蛋白质的分离纯化4蛋白质的分离纯化高效液相层析（高效液相层析（hplc） 高效液相色谱（hplc：high performance liquid chromatography ）与普通的色谱技术不同的是：填料密度高，洗脱液压力加大，分离效果更好。是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少

22、的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。4蛋白质的分离纯化高效液相层析（高效液相层析（hplc） 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。 其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 4蛋白质的分离纯化4蛋白质的分离纯化高效液相层析（高效液相层析（hplc）high pressure liquid chromatographyhig

23、h pressure limits diffusion and increases interactions with chromatography mediahplc gives very high resolution of protein components4蛋白质的分离纯化蛋白质纯化过程实例蛋白质纯化过程实例4蛋白质的分离纯化蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定凯氏定氮法双缩脲法folin-酚法（lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。 ）紫外吸收法bradford法（考马斯亮蓝染料结合法）bca法（bisinchoninic

24、acid method）5蛋白质的含量测定凯氏定氮法5蛋白质的含量测定1.有机物中的氮在强热和cuso4，浓h2so4 作用下，消化生成（nh4）2so4 反应式为： h2so4=so2+h2o+o r. ch.cooh+o=r.co.cooh+nh3 nh3 r.co.cooh+o=nco2+mh2o 2nh3+h2so4=(nh4)2so42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出nh3 ，收集于 h3bo3 溶液中。 反应式为: 2nh4+oh-=nh3+h2o nh3+h3bo3=nh4+h2bo3-3. 再用已知浓度的hcl标准溶液滴定，根据hcl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应

25、的换算因子，既得蛋白质的含量。5蛋白质的含量测定反应式为: (nh4)2b4o7+2hcl+5h2o2nh4cl+4h3bo3 5蛋白质的含量测定考马斯亮兰法（bradford法） 19761976年由年由bradfordbradford建立的考马斯亮兰法（建立的考马斯亮兰法（bradfordbradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮兰马斯亮兰g-250g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmaxlmax），由），由465nm465n

26、m变为变为595nm595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。和芳香族氨基酸残基相结合。 在在595nm595nm下测定的吸光度值下测定的吸光度值a595a595，与蛋白质浓度成正比。，与蛋白质浓度成正比。5蛋白质的含量测定5蛋白质的含量测定bradfordbradford法的突出优点是：法的突出优点是：（1 1）灵敏度高，据估计比）灵敏度高，据估计比lowrylowry法约高四倍，其最低蛋法约高四倍，其最低蛋白质检测量

27、可达白质检测量可达1mg1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowrylowry法法要大的多。要大的多。（2 2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要的测定，只需要5 5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要过程，大约只要2 2分钟即可完成，其颜色可以在分钟即可完成，其颜色可以在1 1小时小时

28、内保持稳定，且在内保持稳定，且在5 5分钟至分钟至2020分钟之间，颜色的稳定性分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像最好。因而完全不用像lowrylowry法那样费时和严格地控制法那样费时和严格地控制时间。时间。（3 3）干扰物质少。如干扰）干扰物质少。如干扰lowrylowry法的法的k+k+、na+na+、mg2+mg2+离子、离子、tristris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edtaedta等均等均不干扰此测定法。不干扰此测定法。5蛋白质的含量测定bradfordbradford法的缺点是：法的缺点是：（1 1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香

29、族氨基酸的含量）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同，因此bradfordbradford法用于不同蛋白质测定时有较大法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。的偏差。（2 2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、去污剂、 triton x-100triton x-100、十二烷基硫酸钠（、十二烷基硫酸钠（sdssds）和）和0.1n0.1n的的naohnaoh。（3 3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beerbeer定律定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的

30、浓进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。度。5蛋白质的含量测定蛋白质的纯度鉴定蛋白质的纯度鉴定电泳 （等电聚焦、sds-page、page）沉降法hplc溶解度分析n末端分析6蛋白质的纯度鉴定6蛋白质的纯度鉴定附录附录 蛋白质组学研究蛋白质组学研究（proteomeproteome） 知道了人类的全部遗传密码即基因组序知道了人类的全部遗传密码即基因组序列，就可以任意控制人的生老病死吗？列，就可以任意控制人的生老病死吗？ 附录蛋白质组学 基因是遗传信息的源头，而功能性蛋白是基因基因是遗传信息的源头，而功能性蛋白是基因功能的执行体。功能的执行体。 基因组计划的实现固然为生物有机体全体基

31、因基因组计划的实现固然为生物有机体全体基因序列的确定、为未来生命科学研究奠定了坚实序列的确定、为未来生命科学研究奠定了坚实的基础，但是它并不能提供认识各种生命活动的基础，但是它并不能提供认识各种生命活动直接的分子基础，其间必须研究生命活动的执直接的分子基础，其间必须研究生命活动的执行体行体- -蛋白质这一重要环节。蛋白质组学蛋白质这一重要环节。蛋白质组学（proteomicsproteomics）研究即旨在解决这一问题。）研究即旨在解决这一问题。附录蛋白质组学附录蛋白质组学蛋白质组学的研究内容包括：蛋白质组学的研究内容包括：1.1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电蛋白质鉴定：可以利用一维电

32、泳和二维电泳并结合泳并结合westernwestern等技术，利用蛋白质芯片和等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。定研究。2.2.翻译后修饰：很多翻译后修饰：很多mrnamrna表达产生的蛋白质表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。白质的功能具有重要作用。附录蛋白质组学 3. 3.

33、蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析物，细胞因子的生物分析/ /配基配基- -受体结合分析。受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物物- -蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。质功能的了解。clontechclontech的荧光蛋白表达系统的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。具。4

34、.4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质可以干预蛋白质- -蛋白质相互作用。蛋白质相互作用。蛋白质组学研究方法附录蛋白质组学 二维电泳二维电泳 酵母双杂交系统：酵母双杂交系统：酵母双杂交技术作为发现和研究在酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术活细胞体内的蛋白质与蛋

35、白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白

36、质之间的互作，也可以用哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。schematic representations of library and matrix yeast two-hybrid screens. (a) a model of the yeast two-hybrid system. the dna-binding domain (bd) and transcriptional activation domain (ad) from a transcription factor are i

37、ndependently fused with candidate interacting proteins (the bait and prey, respectively). if the bait and prey proteins interact (curved line) within a cell expressing both fusions, the resulting functional transcription factor can bind the promoter of a reporter gene and activate its transcription

38、by interacting with the general transcription machinery (g). (b) a library yeast two-hybrid screen. a collection of preys are screened with a bait of interest by transforming yeast cells with plasmids encoding the constructs in order to isolate its interaction partners. (c) a matrix yeast two-hybrid

39、 screen used to generate a protein-protein interaction network. several baits and preys are arrayed in 96-well microtiter plates and the fusion proteins are brought together by mating. diploids containing both bait and prey are isolated on selective plates and protein-protein interactions are ascert

40、ained by expression of the reporter gene. the dark squares indicate an interaction between the bait given at the end of the row and the prey indicated at the top of the column. 抗体芯片：蛋白组学研抗体芯片：蛋白组学研究中一个主要的内容就究中一个主要的内容就是要研究在不同生理状是要研究在不同生理状态或病理状态下蛋白水态或病理状态下蛋白水平的量变，微型化，集平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的芯片就是一个非常好的研究工具，它也是蛋白研究工具，它也是蛋白芯片中发展最快的芯片，芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益而且在技术