叶酸靶向紫杉醇胶束对EMT-6乳腺癌细胞株及动物模型的抗肿瘤作用

1、叶酸靶向紫杉醇胶束对 EMT-6乳腺癌细胞株及动物模型的抗肿瘤作用背景: 乳腺癌已经成为中国女性最常见的恶性肿瘤之一 , 在世界范围内也是 如此。紫杉醇 (Paclitaxel,PTX) 是乳腺癌的一线化疗药物。但其水溶性差 ,且会引起较严重的不良反应 ,如过敏反应等 ,使其临床应用受 到了一定限制 4 。易溶于水、毒性更低的新型紫杉醇药物传送系统就成为研究 的热点。中国科学院应用化学研究所合成了一系列功能性聚乙二醇 -聚(乳酸- 碳酸 酯 )poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide-co-carbonate)及其与紫杉醇和靶向基团的键合物。 但这种药物传递

2、系统对乳腺癌在体内及体外的作用情况仍 未知晓。本研究中, 我们选择叶酸作为靶向基团 ,并制成紫杉醇胶束 (PTX micelles,M(PTX) 和叶酸靶向紫杉醇胶束 (folic acid-bearing polymer-PTX micelles,(M(FA/PTX) 。我们期待这些胶束能拥有多种功能 , 包括水溶性、缓释 作用、生物降解能力、 叶酸受体靶向能力等 , 与目前临床应用的药物剂型相比较 , 疗效相近或更优 , 但副作用更低。目的：探索紫杉醇胶束和叶酸靶向紫杉醇胶束作用于 EMT-6小鼠乳腺癌细胞 株和动物模型的效果 , 检测两种胶束的肿瘤抑制率、肿瘤细胞的凋亡效果和对生 存率的

3、影响。材料与方法：制备含25%PTX勺(M(PTX)和含22.5%PTX勺(M(FA/PTX) 两种PTX键合物胶束。(1)对EMT-6小鼠乳腺癌细胞进行常规培养、传代。应用 MTT法检测PTXM(PTX和(M(FA/PTX)以等量 PTX的不同浓度梯度(10ug/ml、1ug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、1ng/ml)作用EMT-6细胞24、48、72小时的细胞抑制率应用流式细胞仪检测含等量 PTX浓度为1ug/ml时,PTX、M(PTX和(M(FA/PTX) 作用于EMT-6细胞24、48、72小时的细胞凋亡率。应用倒置显微镜观察含等量 PTX 1卩g/ml浓度的PTX M

4、(PTX) M(PTX作用于EMT-6细胞24和72小时的细 胞形态变化。应用Hoechst 33258荧光染色检测含等量 PTX1卩g/ml浓度的PTXM(PTX) M(PTX作用于EMT-6细胞72小时的凋亡指数。制作EMT-6小鼠乳腺癌动物模 型。在抑瘤实验中,分为空白对照、PTX M(PTX和M(FA/PTX)4个组,每组12只 小鼠,给药总剂量为20mg/kg为标准(以等量PTX计算),第5天处死动物。测量瘤 重, 计算肿瘤抑制率。瘤组织一部分做流式细胞检测 , 其余的迅速用 4%多聚甲醛固定 , 石蜡包埋 , 进行H&E染色、Bax和Bcl-2的免疫组化检测。生存实验中,分

5、为空白对照、PTX M(PTX和M(FA/PTX)4个组,每组18只小鼠,给药总剂量为26.7mg/kg为标准(以 等量PTX计算),每日观察记录小鼠生存状态。(3)应用SPSS18.0统计软件，计量资料用均数土标准差描述,组间差异应用 单项方差分析比较，以p<0.05为有统计学意义。计数资料应用 x 2检验进行 样本率间比较 , 以 p<0.05 为有统计学意义。应用 Kaplan-Meier 法计算生存率 , 绘制生存曲线。各组间生存差异比较采用 Log-rank 检验。结果:(1)在体外实验中,MTT试验结果显示在72h时，在1ug/ml的浓度下 M(PTX)

6、和M(FA/PTX)的抑制效果达到最佳。随着作用时间的延长,各组药物对EMT-6乳腺癌细胞生长的抑制率也随之增加流式细胞结果显示在药物作用 72h 时, 各用药组的细胞凋亡率均高于对照组 , 对照组、PTX组、M(PTX组和M(FA/PTX)组的细胞凋亡率分别为 14.4%、20.7%、 19.7%和25.7%,M(FA/PTX)组的细胞凋亡率最高,与其他两用药组比较其差异有 统计学意义(p<0.05)。倒置显微镜下，PTX、M(PTX和M(FA/PTX三种药物作 用于EMT-6小鼠乳腺癌细胞后可以观察到细胞形态较对照组细胞发生明显的改 变。Hoechst 33258染色结果显示

7、对照组、PTX组、M(PTX组和M(FA/PTX)组的 细胞凋亡率分别为5.8%、15.8%、15.2%和21% (2)在体内抑瘤实验中,PTX组的 动物在通过尾静脉给药时,均烦躁不安,持续尖叫,而M(PTX)和M(FA/PTX)两组的 小鼠在给药时均无明显的异常反应出现。在给药5天后,PTX、M(PTX)和M(FA/PTX组的瘤重抑制率分别为 29.0%、46.5% 和54.9%。在组织学观察中,三个用药组均可观察到坏死区域,M(FA/PTX)组的坏 死区域的面积要比PTX和 M(PTX组明显增大。对照组、PTX M(PTX和 M(FA/PTX组的Bax蛋白阳性表达率分别为8.3%、50%

8、60唏口 75%,Bcl-2蛋白阳性表达率分别为 91.7% 40% 60唏口 50% 流式细 胞检测结果显示,对照组、PTX M(PTX)和M(FA/PTX组的细胞凋亡率分别为1.0%、 36.6%、55.9%和 66.1%。生存时间结果显示,对照组、PTX组、M(PTX组和M(FA/PTX组在用药30天 时的生存率分别为 50%、 55.6%、 72.2%和 77.8%,中位生存时间分别为 33天、 31 天、34天和42天(log-rank test:c2=9.789,P=0.02)。结论：在体外细胞试验 中,M(PTX)和 M(FA/PTX)两种药物可以获得与 PTX近似的对EMT-6小鼠乳腺癌细 胞的肿瘤抑制效果,且M(FA/PTX表现出比M(P