蛋白质的一级结构

1、会计学1蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构如：如：H2N丝氨酰丝氨酰亮氨酰亮氨酰苯丙氨酸苯丙氨酸-COOH写为：写为：Ser-Leu-Phe（或（或 S-L-F）前述五肽：丝氨酰前述五肽：丝氨酰-甘氨酰甘氨酰-酪氨酰酪氨酰-丙氨酰丙氨酰-亮氨酸亮氨酸写为：写为：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或（或 S-G-Y-A-L）H2N-COOH肽键肽键缩合缩合l不同肽链的区别在于侧链不同肽链的区别在于侧链R基的排列顺序不基的排列顺序不同同；l相同的氨基酸组成可形成多种不同的多肽链相同的氨基酸组成可形成多种不同的多肽链问题问题1：每种肽链都有相同的分子骨架，试分析多：每种肽链都有相同的分子骨架，试

2、分析多肽分子骨架有哪些结构特征？肽分子骨架有哪些结构特征？ 问题问题2：写出这一肽链的结构：写出这一肽链的结构和名称和名称,这四种氨基酸还可以这四种氨基酸还可以组成几种寡肽？组成几种寡肽？问题问题3：肽链中可解离基团的（：肽链中可解离基团的（-COOH，-NH2 及侧链可解离基及侧链可解离基团团）pKa与游离氨基酸中对应基团与游离氨基酸中对应基团的的pKa值有何不同？为什么？值有何不同？为什么？ 问题问题4 ：丛肽链的组成与结构分析：丛肽链的组成与结构分析多肽有哪些主要性质？多肽有哪些主要性质？l肽具有等电点，调节溶液肽具有等电点，调节溶液pH值可改变肽的带值可改变肽的带电状况，使肽不带电荷而

3、处于等电状态时的电状况，使肽不带电荷而处于等电状态时的pH值为肽的等电点值为肽的等电点肽等电点的差别可不同程度反映其氨基酸组成上肽等电点的差别可不同程度反映其氨基酸组成上的差异；反之亦然。的差异；反之亦然。等电状态时，肽在电场中不向任何一方移动等电状态时，肽在电场中不向任何一方移动不同大小的肽片断可用双向凝胶电泳进行分离不同大小的肽片断可用双向凝胶电泳进行分离肽链中的解离基团可被滴定，但肽链中的解离基团可被滴定，但 肽的滴定曲线复肽的滴定曲线复杂杂短肽以离子晶体存在，具有较高的熔点短肽以离子晶体存在，具有较高的熔点肽键上的基团具有相应的化学反应活性。肽键上的基团具有相应的化学反应活性。 体内许

4、多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽促甲状腺素释放激素促甲状腺素释放激素TRF焦谷氨酸焦谷氨酸 组氨酸组氨酸 脯氨酰胺脯氨酰胺谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CC NH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH过氧化物酶过氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+L-天冬氨酰天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，称作：苯丙氨酰甲酯，称作：aspartame2.7 蛋白质是由一条或几条多肽链组成的具有蛋白质是由一条或几条多肽链组成的具有特定空间结构和功能的生物大分子特定空间结构和功能的生物大分子单纯蛋白质单纯蛋白质(simple prot

5、ein)(simple protein)结合蛋白质结合蛋白质 = = 蛋白质蛋白质 + + 非蛋白质非蛋白质(辅基)(prosthetic group) (conjugated protein)辅基种类很广，常见的有辅基种类很广，常见的有色素化合物、寡糖、脂类色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子甚至核、磷酸、金属离子甚至核酸酸l根据组成不同蛋白质可分为根据组成不同蛋白质可分为纤维状蛋白质纤维状蛋白质(fibrous protein)(fibrous protein)球状蛋白质球状蛋白质(globular protein) (globular protein) 肌动蛋白肌动蛋白毛发中的角蛋白毛

6、发中的角蛋白蚕丝丝心蛋白蚕丝丝心蛋白寡聚蛋白寡聚蛋白(oligomeric protein)(oligomeric protein) 或多体蛋白或多体蛋白(multimeric (multimeric protein) protein) 单体蛋白单体蛋白(monomeric protein) (monomeric protein) 异型多体蛋白异型多体蛋白(heteromultimeric (heteromultimeric protein) protein) 同型多体蛋白同型多体蛋白(homomultimeric (homomultimeric protein) protein) 寡聚蛋白中

7、的每一个具三级结构的多肽链称寡聚蛋白中的每一个具三级结构的多肽链称亚亚基基(subunit)(subunit) 2.8.1 多数球状蛋白质溶于水形成胶体溶液多数球状蛋白质溶于水形成胶体溶液蛋白质溶胶性质：蛋白质溶胶性质：a.a.质点大小在胶体范围：质点大小在胶体范围：1 1100nm100nm b.b.丁达尔效应丁达尔效应c.c.布朗运动布朗运动d.d.不能透过半透膜不能透过半透膜2.8 根据蛋白质的结构和性质特点可对蛋白根据蛋白质的结构和性质特点可对蛋白质进行分离鉴定质进行分离鉴定l 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。所

8、带的电荷和水化作用有关。 破坏蛋白质胶体的稳定因素，将促使蛋破坏蛋白质胶体的稳定因素，将促使蛋白质沉淀析出白质沉淀析出蛋白质处于蛋白质处于PI时，净电荷为零。溶解度最低时，净电荷为零。溶解度最低不同蛋白质不同蛋白质等电点不同等电点不同 调节调节pH值值将蛋白质彼此分开将蛋白质彼此分开2.8.3 加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出加入大量中性盐可使蛋白质沉淀析出l低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度，即低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度，即盐溶盐溶l原因：原因：蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，且与水分子相互作用加强；子彼此排斥，且与

9、水分子相互作用加强；2.8.4 有机溶剂分级分离法：有机溶剂分级分离法：作用原理：作用原理：有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反有机溶剂的加入改变了介质的介电常数，增加了两个相反电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度电荷之间的吸引力，蛋白质的表面可离解基团的离子化程度减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。减弱，水化程度降低，蛋白质分子聚集沉淀。有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体形成有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集体形成并沉淀。并沉淀。2.8.5 离子交换层析离子交换层析l原理：原理：样品中各蛋白质组分的净电荷、分子大小不样品中各蛋白质组分的净电

10、荷、分子大小不同，与固定相间的作用力不同而被分离同，与固定相间的作用力不同而被分离l洗脱方法：改变洗脱剂的盐浓度、洗脱方法：改变洗脱剂的盐浓度、PHPH值依次洗脱值依次洗脱l结合力小的蛋白质先由层析柱中洗脱出来结合力小的蛋白质先由层析柱中洗脱出来l分离效果与溶液中的离子强度、分离效果与溶液中的离子强度、pHpH有关有关l常用固定相：常用固定相：离子化纤维素离子化纤维素羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（CMCM），二乙基氨基乙基），二乙基氨基乙基(DEAE)(DEAE)纤维素纤维素优点：优点：具有松散的亲水性网状结构，及较大的表面积，大具有松散的亲水性网状结构，及较大的表面积，大分子可以自由通过分子可

11、以自由通过交换容量大交换容量大, ,洗脱条件温和洗脱条件温和, ,回收率高。回收率高。l离子化葡聚糖离子化葡聚糖交联葡聚糖作基质交联葡聚糖作基质优点：优点：交换容量比离子交换纤维素大交换容量比离子交换纤维素大3 34 4倍。倍。Cation-exchangecolumnpH=5.0时，基质带负时，基质带负电荷电荷蛋白组分带不同电荷蛋白组分带不同电荷逐渐提高洗脱液的逐渐提高洗脱液的pH值，各组分以值，各组分以此被洗脱下来此被洗脱下来问：洗脱顺序？问：洗脱顺序？即即分子排阻层析分子排阻层析（也称（也称凝胶过滤层析，分子筛层析凝胶过滤层析，分子筛层析）2.8.6 凝胶过滤：凝胶过滤：原理：原理：凝胶

12、颗粒内部为多孔的网状结构。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。当不同当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外。不同分子大小路径不同的自由出入凝胶珠的内外。不同分子大小路径不同洗脱：洗脱：大分子大分子-先洗脱出来先洗脱出来 小分子小分子-后洗脱出来后洗脱出来基础：基础

13、：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）一种称配基的分子能特异而非共价的结合）蛋白质样品加入到蛋白质样品加入到连有配基连有配基的基质中（固定相）的基质中（固定相）目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上 其它蛋白质先被洗脱下来其它蛋白质先被洗脱下来 结合在基质上的蛋白结合在基质上的蛋白 可用由配体溶液洗脱可用由配体溶液洗脱Affinitychromatography2.8.8 利用蛋白质的带电性可对蛋白质进行电利用蛋白质的带电性可对蛋白质进行电泳分离泳分离l非变性聚丙烯酰胺凝

14、胶电泳非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质在蛋白质在(PAGE)(PAGE)介质中电泳时，其迁移率介质中电泳时，其迁移率 聚丙烯酰胺凝胶系统中加入聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDSSDS和少量巯基乙醇和少量巯基乙醇lSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：聚丙烯酰胺凝胶电泳法： 则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量则电泳迁移率主要取决于其相对分子质量(q/r(q/r），而与电荷和分子形状无关。），而与电荷和分子形状无关。 SDSSDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

15、因此，所有蛋白质间原有的电荷差别。因此，所有SDS-SDS-蛋白质蛋白质复合物，电泳时均以同样的复合物，电泳时均以同样的电荷电荷/ /分子质量分子质量比向正比向正极移动。极移动。 改变了蛋白质单体分子的构象。改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-SDS-蛋白质蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,1.8nm,长轴长长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。 可用来测量蛋白质的分子量可用来测量蛋白质的分子量l区带电泳区带电泳：外加电场：外加电场时，蛋白质时，蛋白质混合物在具混合物在具有有pHpH梯度的梯度的介质中移

16、向介质中移向并聚焦（停并聚焦（停留）在等于留）在等于其等电点的其等电点的pHpH处，形成处，形成区带。区带。测定蛋白质含量的常用方法测定蛋白质含量的常用方法：凯氏定氮法：凯氏定氮法： 紫外吸收法紫外吸收法双缩脲法：双缩脲法：Folin-Folin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）：考马斯亮蓝法（现最常用的方法）考马斯亮蓝法（现最常用的方法）：胶体金法：胶体金法：带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质带负电的疏水胶体，洋红色，遇蛋白质变蓝色，灵敏度最高变蓝色，灵敏度最高n多肽链一级结构决定着蛋白质的高级结构和多肽链一级结构决定着蛋白质的高级结构和功能功能2.9 蛋白质一级结构的测定蛋

17、白质一级结构的测定即蛋白质多即蛋白质多肽链中氨基酸序列的测定肽链中氨基酸序列的测定高级结构高级结构蛋白质一级结构测定策略蛋白质一级结构测定策略l变性：变性：8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/LHCI6mol/LHCI，或高浓度盐溶液，或高浓度盐溶液l如有如有二硫键交联二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理：巯基乙醇，或过氧乙酸处理l凝胶过滤或电泳分离不同肽链凝胶过滤或电泳分离不同肽链蛋白质中多肽链的拆分蛋白质中多肽链的拆分蛋白质中多肽链数目的确定蛋白质中多肽链数目的确定确定氨基酸组成确定氨基酸组成多肽多肽 OCCHNH2 +R+ HCI弱碱性弱碱性+ DNS-氨基酸氨基酸酸水解酸水解

18、游离氨游离氨基酸基酸有机溶剂萃取有机溶剂萃取溶于水溶于水定量定量 + 定性定性确定确定N末端氨基酸末端氨基酸确定肽链数目确定肽链数目多肽多肽 OCCHNHRDNS-氨基酸氨基酸溴化氰法：溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键Edman reagentPTC-多肽多肽少一个少一个N-末端末端氨基酸的肽链氨基酸的肽链层析色谱鉴定层析色谱鉴定重复重复与与DNS法联合法联合Structure”(蛋白质序列和结构图册）蛋白质序列和结构图册）中查找中查找nn蛋白质的一结构是其形成特定三级结构蛋白质的一结构是其形成特定三级结构和行使特定功能的基础和行使特定功能的基础高铁血红蛋

19、白-链和-链肌红蛋白肌红蛋白Cytc系统树系统树问题问题2：写出这一肽链的结构：写出这一肽链的结构和名称和名称,这四种氨基酸还可以这四种氨基酸还可以组成几种寡肽？组成几种寡肽？Cation-exchangecolumnpH=5.0时，基质带负时，基质带负电荷电荷蛋白组分带不同电荷蛋白组分带不同电荷逐渐提高洗脱液的逐渐提高洗脱液的pH值，各组分以值，各组分以此被洗脱下来此被洗脱下来问：洗脱顺序？问：洗脱顺序？基础：基础：基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另基于蛋白质所具有的生物学特异性。（它与另一种称配基的分子能特异而非共价的结合）一种称配基的分子能特异而非共价的结合）蛋白质样品加入到蛋白质样品加入到连有配基连有配基的基质中（固定相）的基质中（固定相）目标蛋白质与配体结合，吸附在琼质糖颗粒上目标蛋白质与配体结合，吸