疾病基因序列分析

1、会计学1疾病基因序列分析疾病基因序列分析第1页/共71页此实验共包括如下六个部分此实验共包括如下六个部分1. 1.第一部分，目的基因选择第一部分，目的基因选择2. 2.第二部分，第二部分，PCRPCR引物设计引物设计3. 3.第三部分，第三部分，PCRPCR实验操作实验操作4. 4.第四部分，第四部分，PCRPCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定5. 5.第五部分，第五部分，PCRPCR产物测序鉴定产物测序鉴定6. 6.第六部分，目的基因序列变异分析第六部分，目的基因序列变异分析 第2页/共71页第一部分第一部分 目的基因选择目的基因选择候选基因简介候选基因简介 在本实验中，有三个候选基因，分别是在本

2、实验中，有三个候选基因，分别是NGALNGAL，FascinFascin和和EzrinEzrin。 这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。瘤的发生发展中起重要的生物学作用。 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表SCISCI收录研究论收录研究论文文2020余篇，已形成系列优势。余篇，已形成系列优势。 同学们可查阅相关资料，选择感兴趣

3、的基因来做同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做PCRPCR实验。实验。第3页/共71页 NGALNGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalinneutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin) lipocalin) 家族的一个成员。家族的一个成员。 NGALNGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9 -9的活性，作为的活性，作为小分

4、子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，外，NGALNGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。 NGAL NGAL 基因基因第4页/共71页NGALNGAL的的mRNAmRNA信息在信息在NCBINCBI核酸数据库中有来自不同核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有BC033089BC033089和和NM_005564NM_005564等，编码区长为等，编码区长为597 bp597 bp，

5、编码，编码198198个氨基酸个氨基酸，包含了，包含了N N端前部长为端前部长为2020个氨基酸的信号肽序列（为核个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的酸序列的1-60 bp1-60 bp）信号肽预测网站信号肽预测网站http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/信号肽信号肽 (signal peptide): (signal peptide): 某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的形式合成，其形式合成，其N N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种

6、氨基酸序列称信号肽或信号序列（称信号肽或信号序列（signal sequencesignal sequence）。）。 第5页/共71页NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：前前2020个个AAAA为信为信号肽序列号肽序列第6页/共71页20012001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系系SHEE SHEE 和食管癌细胞系和食管癌细胞系SHEEC SHEEC 互为对照，用互为对照，用cDNA cDNA 微列阵进行筛选，用微列阵进行筛选，用RNA

7、 RNA 印迹和印迹和RT-RT-PCR PCR 进行鉴定，进行鉴定，cDNA cDNA 克隆测序后与克隆测序后与GenBank GenBank 进行进行BLAST BLAST 分析比较。结果表明分析比较。结果表明NGAL NGAL 基因基因在在SHEECSHEEC中出现显著差异过表达，其中出现显著差异过表达，其cDNA cDNA 序列与小鼠序列与小鼠24p324p3、大鼠、大鼠NRL (neu-related NRL (neu-related lipocalin) lipocalin) 和人中性粒细胞和人中性粒细胞NGAL NGAL 具有较高的相似性。这提示具有较高的相似性。这提示NGAL

8、NGAL 基因在永生化食管上皮基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因芯片筛选两种细胞的差异表达基因A.A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE SHEE B.B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEEC SHEEC A B C反转录反转录PCRPCR检测检测NGALNGAL在两种细胞的在两种细胞的mRNAmRNA水平水平A.A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE SHEE B.B.食管癌细胞系食管癌细

9、胞系SHEECSHEECC. 100 bp DNA markerC. 100 bp DNA marker第7页/共71页 FascinFascin蛋白的蛋白的mRNAmRNA全长为全长为2767bp2767bp，由，由55端非翻译区端非翻译区111bp111bp碱基，碱基，33端端非翻译区非翻译区1174bp1174bp碱基，碱基，1482bp1482bp的全编码序列区和的全编码序列区和6 6个个PloyAPloyA信号肽组成，信号肽组成，编码编码493493个氨基酸，分子量约为个氨基酸，分子量约为55kD55kD。 FascinFascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶蛋白定位于细胞质

10、张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)(ruffles)，边缘的丝状伪，边缘的丝状伪足足(filopodia)(filopodia)、微棘、微棘(microspikes)(microspikes)的核心肌动蛋白束中。的核心肌动蛋白束中。Fascin Fascin 基因基因第8页/共71页以往研究发现，以往研究发现，FascinFascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌如宫颈癌HelaHela、胃癌、胃癌AGSAGS、大肠癌、大肠癌LM1215LM1215和和SW480SW480、胰腺、胰腺癌癌BxPC3BxPC3和和T3H4T3H4等细胞系中均上调表达

11、。等细胞系中均上调表达。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示切关系，提示FascinFascin蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。细胞间信息交流等过程中发挥作用。第9页/共71页ATGACCGCCAACGGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGC

12、TGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAGTCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCA

13、CCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCGCGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGG

14、TGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAGTGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGA

15、GGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTGGACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTC

16、CTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFGFKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPA

17、DEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSKNASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNK

18、VAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascinFascin基因的编码区序列基因的编码区序列FascinFascin基因的蛋白序列基因的蛋白序列第10页/共71页FascinFascin蛋白的三级结构：由蛋白的三级结构：由4 4个个-三叶草结构组成，含多个三叶草结构组成，含多个 折叠折叠第11页/共71页目前已有课题组发现，在永生化食管上皮细胞目前已有课题组发现，在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化的恶性转化中，中，Fascin基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到Fascin

19、蛋白呈阳性表达。蛋白呈阳性表达。Fascin在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们设计并合成了靶向设计并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA，试图通过，试图通过RNA干扰的方法减少干扰的方法减少Fascin基因的表基因的表达，从而探讨达，从而探讨Fascin对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。扫描电镜结果显示抑制扫描电镜结果显示抑制Fascin表达后，表达后，EC109细胞突触形成明显减少。细胞突触形成明显减少。第12页/共7

20、1页细胞免疫荧光结果显示代表细胞免疫荧光结果显示代表Fascin蛋白的绿色荧蛋白的绿色荧光在被干扰细胞（光在被干扰细胞（A）中要比对照细胞（）中要比对照细胞（B）的）的弱弱AB第13页/共71页第14页/共71页EzrinEzrin基因基因 EzrinEzrin为为ERMERM（Ezrin,radixin,moesinEzrin,radixin,moesin ）蛋白家族成员之一，）蛋白家族成员之一，ERMERM家族成员家族成员大多位于丝状突和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜大多位于丝状突和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样可维持细胞膜表

21、面的一些特殊结构和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。，如微绒毛和细胞膜突起等。 ERMERM家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用参与细胞粘附作用降。与基质之间的相互作用参与细胞粘附作用降。第15页/共71页ERMERM家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过Rho-GTPRho-GTP酶参与信号转酶参与信号转导。导。EzrinEzrin含有含有585585个氨基酸，等电点为个氨基酸，等电点为6.156.15，理论

22、分子量为，理论分子量为69kD69kD。EzrinEzrin分子带有大量电荷（分子带有大量电荷（38.5%38.5%的氨基酸残基带电荷），这可能是导致的氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因（它的理论分子量与实际分子量不同的原因（EzrinEzrin实际分子量为实际分子量为80kD80kD）。第16页/共71页EzrinEzrin定位与染色体定位与染色体6q25.2-q266q25.2-q26，DNADNA长度为长度为17611761个碱基，含个碱基，含1313个外显子。个外显子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCA

23、GAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACTATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAG

24、ATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGACTACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACA

25、GACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCAAAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCAT

26、CAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGAGAAAGAGCAGATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGATTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGTATGGCTGCACTGCGGGCTAAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAG

27、GAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAATACACTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAGGCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAG

28、GAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACGCTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGCGCATCGACGAGTTCGAGGCCCTGTAAEzrinEzrin的编码区序列的编码区序列第17页/共71页Ezrin蛋白含有四个功能域蛋白含有四个功能域名称名称起始起始终点终点功能功能FERM_N 986将

29、胞浆蛋白连接到膜上将胞浆蛋白连接到膜上FERM_M 88206FERM_C 210299ERM 338586结合胞浆蛋白结合胞浆蛋白第18页/共71页第19页/共71页目前已发现目前已发现Ezrin在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布和在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布和胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明Ezrin细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。第20页/共

30、71页第二部分，第二部分，PCR引物设计引物设计引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如primer premier5、Oligo和北京军事医学科学院李伍举教授开发的和北京军事医学科学院李伍举教授开发的Biosun等，等，Internet免费引物设计网站有免费引物设计网站有primer 3，Primerfinder等。等。引物设计有以下几个原则：引物设计有以下几个原则：（1 1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过

31、7070的同源性或连续的同源性或连续8 8个的碱基互补，减少非特异产物；个的碱基互补，减少非特异产物；（2 2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在55端额外端额外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以181824 bp24 bp为佳。为佳。第21页/共71页（3 3）引物）引物33末端的碱基。引物末端的碱基。引物33末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是个碱基是A A时，容易发生错配，所以引物时，

32、容易发生错配，所以引物33末端最好不要为末端最好不要为A A；（4 4）引物的）引物的G+CG+C含量一般为含量一般为40406060，过高或过低都不利于引发反应；，过高或过低都不利于引发反应；（5 5）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。影响引物与模板的结合。（6 6）两条引物的融解温度）两条引物的融解温度TmTm值尽量不要相差太大，引物的值尽量不要相差太大，引物的TmTm值粗略计算公式为值粗略计算公式为Tm = 4 Tm = 4 （G+CG+C）+2+

33、2（A+TA+T）；）；（7 7）引物的）引物的5 5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物55端端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物3 3端是延伸的开始，不能进行任何修端是延伸的开始，不能进行任何修饰。饰。第22页/共71页引物设计软件引物设计软件primer premier 5.0primer premier 5.0的使用的使用第23页/共71页可通过两个方法将序列输入软件中可通过两个方法将序列输入软件中在表中粘贴序列在表中粘贴序列打开原有的序列文

34、件打开原有的序列文件第24页/共71页选择序列文选择序列文件所在位置件所在位置第25页/共71页 在对话框中输入待扩增序列在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的点击左上角的“Primer”Primer”按钮按钮第26页/共71页Hairpin: Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: Cross Dimer: 正向与反向引

35、物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体引物设计界面引物设计界面正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左每点击左边红色的边红色的按钮，就按钮，就出现相应出现相应的内容的内容对正向和反向引物进行编辑对正向和反向引物进行编辑第27页/共71页可对引物进行增加或减少碱基可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入了用键盘输入了5 5个碱基个碱基第28页/共71页引物的信息引物的信息改动后引物的信息改动后引物的信息第29页/共71页重新回到双引物的界面重新回到双引物的界面第30页/共71页“Edit”“Copy

36、”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3输出引物序列输出引物序列第31页/共71页 了解并掌握了解并掌握PCRPCR基因扩增的基本原理基因扩增的基本原理 熟悉熟悉PCRPCR基因扩增技术的具体操作过程基因扩增技术的具体操作过程 实验目的实验目的第三部分第三部分 PCRPCR实验操作实验操作第32页/共71页一、概述一、概述 PCRPCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNADNA合成合成 酶酶和四种脱氧核糖核酸进行和四种脱氧核糖核酸进行DNADNA的体外合成反应。的体外合成反应

37、。 PCRPCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪该技术在上个世纪8080年代中期由美国年代中期由美国K.MullisK.Mullis发明建立，经过近二十年发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.MullisK.Mullis也因此也因此获得获得19931993年度的诺贝尔化学奖。年度的诺贝尔化学奖。第33页/共71页二、二、PCRP

38、CR基本原理基本原理 DNADNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶、引发酶、连接酶、引发酶、RNARNA引物、四种脱氧核糖核引物、四种脱氧核糖核酸、酸、DNADNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。 PCRPCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNADNA复制，所复制，所以在一个以在一个PCRPCR中必需成分是中必需成分是 1. 1. 模板模板DNADNA 2. DNA 2. DNA

39、聚合酶聚合酶 3. 3. 四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸 4. 4. 正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5. 5. 适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。第34页/共71页 模板序列：待扩增的模板序列：待扩增的DNADNA序列，一般为双链的序列，一般为双链的DNADNA可包括线形双可包括线形双螺旋螺旋DNADNA，如基因组，如基因组DNADNA，及闭环双链，及闭环双链DNADNA，如质粒；，如质粒； 模板的来源很广，如从细胞模板的来源很广，如从细胞/ /细菌中提取基因组细菌中提取基因组DNADNA、提取、提取mRNAmRNA经反转录得到经反转录得到cDNAcDNA、质粒、病毒等；、质粒、病毒等

40、； 每个反应中模板的量为每个反应中模板的量为1 ng1 ng1 g1 g。质粒。质粒DNADNA和纯化的和纯化的DNADNA的量可的量可少一些，而基因组少一些，而基因组DNADNA的量应多一些。的量应多一些。 PCRPCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致否则会导致PCRPCR的非特异性扩增。的非特异性扩增。1. 1.模板模板DNADNA第35页/共71页引物（引物（primerprimer）也称为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCRPCR反应需要两种引物，分别成为反应需要两种引物，分别成为5

41、5端引端引物和物和33端引物，或称为正向引物和反向引物。端引物，或称为正向引物和反向引物。通常通常DNADNA及及mRNAmRNA序列的写法为序列的写法为5353，所以，所以55端引物与目的序列的端引物与目的序列的55末端序列相末端序列相同，而同，而33端引物与目的序列的端引物与目的序列的33末端序列反向互补。末端序列反向互补。2. 2.引物引物 它们作为它们作为DNADNA扩增的起始部分，能限定待扩增扩增的起始部分，能限定待扩增DNADNA序列的长度。序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有151518

42、bp18bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物第36页/共71页 DNADNA聚合酶：以聚合酶：以DNADNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNADNA的一种的一种酶。酶。 早期的早期的PCRPCR反应使用的反应使用的DNADNA聚合酶为大肠杆菌聚合酶为大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow片段。但该片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。 随着新的耐热随着新的耐热DNADNA聚合

43、酶的发现及在聚合酶的发现及在PCRPCR反应中的应用，使反应中的应用，使PCRPCR操作更方便，产操作更方便，产量更稳定。量更稳定。 目前商品化的目前商品化的DNADNA聚合酶有聚合酶有TaqTaq DNA DNA聚合酶和聚合酶和PfuPfu DNA DNA聚合酶。聚合酶。TaqTaq DNA DNA聚合酶最适工作温度为聚合酶最适工作温度为75-8075-80。该酶具有。该酶具有5353聚合酶活性，在镁离聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿子存在情况下可催化核苷酸沿5353方向发生聚合反应。方向发生聚合反应。3. DNA3. DNA聚合酶聚合酶第37页/共71页4. 4.脱氧核糖核酸脱

44、氧核糖核酸 四种脱氧核苷三磷酸即四种脱氧核苷三磷酸即dATPdATP、dTTPdTTP、dCTPdCTP和和dGTPdGTP，为，为PCRPCR反应中反应中DNADNA合成原料。合成原料。 在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。合成速度。第38页/共71页 缓冲液提供缓冲液提供PCRPCR反应所必需的合适酸碱度与离子反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有环境。主要成分有KClKC

45、l、Tris-ClTris-Cl和和MgClMgCl2 2。 其中其中MgMg2 2的浓度最重要，它能影响的浓度最重要，它能影响DNADNA聚合酶的聚合酶的活性，以及模板与活性，以及模板与PCRPCR产物的解链温度。产物的解链温度。5. 5.缓冲液缓冲液第39页/共71页1. 1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNADNA成为单链的成为单链的DNADNA分子；在应用分子；在应用TaqTaq DNA DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR反应时，变性往往在反应时，变性往往在94949595条件下进行。这也是条件下进行。这也是TaqTaq DNA DNA聚合酶

46、进行聚合酶进行3030个左右的个左右的PCRPCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。的最适温度。2. 2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低核苷酸引物的熔解温度低5 51010，PCRPCR实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。二、二、PCRPCR基本步骤基本步骤第40页/共71页3. 3.延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，DNADNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加聚合酶按碱基互补

47、原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的在引物的33端，使引物沿端，使引物沿5353方向生成与模版方向生成与模版DNADNA互补的新互补的新DNADNA链。链。双链模版双链模版DNADNA变性变性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循环多次循环（2 2n n 拷贝）拷贝）第41页/共71页下面为一个典型的下面为一个典型的PCRPCR循环参数设置：循环参数设置：备注：备注：* 比两条引物的比两条引物的Tm值值低低510。94 5 min 94

48、 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-3525-35个循环个循环第42页/共71页三、影响三、影响PCRPCR因素因素 虽然虽然PCRPCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCRPCR的特异的特异性和高效性。性和高效性。1. 1. 引物引物2. 2. 变性温度和时间变性温度和时间3. 3. 退火温度和时间退火温度和时间4. 4. 延伸温度和时间延伸温度和时间5. 5. 循环次数循环次数第43页/共71页 引物决定了引物决定了PCRPCR产物的长度和特异性。产物的长度和特异性。 引物的设计要求请看本实验讲义引物的设

49、计要求请看本实验讲义“引物设引物设计计”部分。部分。1. 1.引物引物第44页/共71页 在在PCRPCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNADNA完全变完全变性成单链性成单链DNADNA，一般设为，一般设为9595、5 min5 min；在随后的循环中，；在随后的循环中，可设为可设为9595、30s30s。 有些模板有些模板DNADNA的的G+CG+C含量较高，变性温度就越高。太高的含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响变性温度和太长的变性时间会影响DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2. 2.变性温度和时间变性温度和时间第

50、45页/共71页 退火温度与引物的退火温度与引物的TmTm值相关，一般比值相关，一般比TmTm值低值低510510。 退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低引物与模板的结合而降低PCRPCR效率。效率。 在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为性结合或形成引物二聚体。退

51、火时间设置为30s30s基本上就足够了。基本上就足够了。3. 3.退火温度和时间退火温度和时间第46页/共71页 所用所用DNADNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如TaqTaq聚合酶的聚合酶的最佳温度为最佳温度为70708080度，所以延伸温度设为度，所以延伸温度设为7272即可。即可。 在实践中在实践中Taq Taq DNADNA聚合酶的延伸效率约为聚合酶的延伸效率约为500 bp/30 s500 bp/30 s，若待扩增的，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。

52、4. 4.延伸温度和时间延伸温度和时间第47页/共71页 在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，等因素，PCRPCR产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。 循环次数设为循环次数设为25302530次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。5. 5.循环次数循环次数第48页/共71页1. 1.DNADNA模板：以模板：以pPIC9-N

53、GALpPIC9-NGAL为模板，来扩增不包含信号肽序列的为模板，来扩增不包含信号肽序列的NGALNGAL编码区编码区2. 2.引物：引物： PCRPCR上游引物（上游引物（P1P1）：）：5-CGC5-CGCCTCGAGCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3AAAAGACAGGACTCCACCTCA -3 PCR PCR下游引物（下游引物（P2P2）：）：5-CG5-CGGAATTCGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3TCAGCCGTCGATACACTGGTC -3 底下有横线的碱基为酶切位点：底下有横线的碱基为酶切位点：XholXholI (P

54、1)I (P1)，EcoREcoRI(P2)I(P2)3. 3.2 2Taq PCR Master Mix Taq PCR Master Mix （广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为：（广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为： 0.1 U 0.1 U TaqTaq DNA Polymerase/ml DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 500 mM dNTP each 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 20 mM KCl 4 mM MgCl2 4 mM MgCl2 4. 4.

55、无菌水无菌水5. 5.100bp plus ladder DNA marker100bp plus ladder DNA marker本实验所用试剂本实验所用试剂第49页/共71页实验操作实验操作95 2min95 2min94 30s94 30s60 30s 60 30s 72 30s72 30s72 5min72 5min30个循环个循环1. 1.按以下次序将各成分加按以下次序将各成分加PCRPCR管中。管中。 2 2Taq PCR MasterMix 5 lTaq PCR MasterMix 5 l P1 (12.5 M ) 1 l P1 (12.5 M ) 1 l P2 (12.5 M

56、) 1 l P2 (12.5 M) 1 l 无菌水无菌水 2 l2 l pPIC9-NGAL 1 l pPIC9-NGAL 1 l 反应体系：反应体系：10 l10 l混匀，稍加离心并标记。混匀，稍加离心并标记。2. 2.PCRPCR反应于反应于ABI 2720 Thermer cyclerABI 2720 Thermer cycler进行，进行，PCRPCR反应条件：反应条件： 第50页/共71页 凝胶准备凝胶准备 称称1g1g琼脂糖置三角瓶中，加琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1100ml 1TAETAE； 微波炉加热大约微波炉加热大约2 2分钟，熔化琼脂糖；分钟，熔化琼脂糖； 熔化的琼脂

57、糖自然冷却到熔化的琼脂糖自然冷却到60607070时，加入时，加入EB 5lEB 5l，并轻轻混匀。，并轻轻混匀。 胶床准备胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm1mm的间隙的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；将胶床放在调整好的水平台上； 铺胶：将冷却致铺胶：将冷却致6060的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm5 mm； 室温下静置室温下静置3030分钟左右，凝胶固化。将带凝胶分钟左右，凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中，的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；并使样

58、品孔位于电场负极；第四部分第四部分 PCRPCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定第51页/共71页 向电泳槽中加入向电泳槽中加入1 1TAETAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/61/6的上样缓冲液，用加样器的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀轻轻混匀 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10l10l 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；盖上电泳槽，接通电源，开始

59、电泳； 电泳条件：电压电泳条件：电压80v80v；时间；时间20202525分钟；分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶；电泳结束后，切断电源，取出凝胶； 电泳结果分析：电泳结果分析： 紫外检测仪直接观察电泳条带紫外检测仪直接观察电泳条带 摄影记录摄影记录 第52页/共71页琼脂糖凝胶电泳预期结果：琼脂糖凝胶电泳预期结果：500 bp560 bp第53页/共71页PCRPCR产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收产物的直接测序：从琼脂糖凝胶中回收PCRPCR产物后测序。产物后测序。 PCRPCR产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收产物连接到载体后测序：从琼脂糖凝胶中回收PCRPCR产物，利用连

60、接酶将产物，利用连接酶将PCRPCR产产物连接到载体如物连接到载体如pGEM-TpGEM-T后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。后，转化大肠杆菌提取质粒后测序。美国应用生物系统公司美国应用生物系统公司 3130 3130 基因分析仪基因分析仪 24 24 小时无人监控操作小时无人监控操作 仪器设置更方便更简单仪器设置更方便更简单 新型自动灌胶系统进行灌胶新型自动灌胶系统进行灌胶 检测池加热器改进了温度控制检测池加热器改进了温度控制 通过通过 96 96 孔和孔和 384 384 孔板自动进样孔板自动进样 多色荧光检测多色荧光检测 第五部分第五部分 PCRPCR产物测序鉴定产物测序鉴定第54页/共7