细胞及细胞工程实验

1、实验一 细胞的凝集反应1、 实验目的了解细胞膜的表面结构；2、 实验原理凝集素是一类可逆结合特异糖基的蛋白质，能与细胞外被的寡糖链相连接，使细胞发生凝集。3、 实验用品1 器材: 显微镜、天平、载玻片、滴管、离心管、烧杯、10ml移液管、试管、试管架2 材料: 土豆块茎、 2 鸡血红细胞3 试剂: 抗凝血剂（ 3.8%柠檬酸钠）、PBS缓冲液（pH 7.4 0.2mol/L Na2HPO4 49ml + 0.2mol/L NaH2PO4 51ml, PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用）、0.17mol/L氯化钠。4、 实验步骤1 鸡血红细胞悬液制备取已加抗凝剂的新鲜鸡血1 mL，加

2、等量生理盐水轻轻混匀后2000 r/min离心 min，重复3次，按红细胞压积用生理盐水配成鸡血红细胞悬液（淡红色）。2 土豆凝集素制备 土豆克切成薄片后加10 ml PBS，浸泡0.5-2 h（写具体时间，80min）3 细胞凝集反应制备不同浓度梯度的红细胞液：取1ml已制备好的2%的鸡血细胞悬液，通过系列稀释将血细胞悬液制备成不同浓度：在1ml的试管上编号为2%；在标号2%的试管中取0.5ml于另一只试管中，在试管中加入0.5ml生理盐水，混合均匀并编号1%；在1%的试管中取0.5ml的细胞悬液于另一只试管中，并加入0.5ml的生理盐水，混合均匀编号0.5%；梯度稀释制备不同浓度的土豆悬浮

3、液：取1ml的土豆凝集素悬浮液原液于其中一只试管中，并编号1×；另取0.5ml的土豆悬浮液原液于另一只试管中，加入0.5ml的PBS缓冲液，并编号0.5×；再取一只试管，加入1ml的PBS缓冲液，并编号0×；土豆凝集素滴、鸡血红细胞液滴载玻片上混匀，静置min（写实际时间，5min）思考题：1、 生理盐水可以用蒸馏水代替吗？为什么？不能用蒸馏水代替。生理盐水的渗透压与血浆的渗透压相当，用生理盐水是为了维持渗透压，保持细胞正常形态,防止发生细胞破裂。2、 如果你在显微观察时，看到很多碎片状小块发生凝集，而不是圆形的细胞，请分析可能导致这种现象的原因可能是盖玻片压片时

4、细胞破碎实验二 MS培养基的配制一、实验目的了解MS培养基的组成、掌握MS培养基的配制方法二、 实验原理植物生长发育需要多种营养成分，在配制之前，将各种成分按要求的比例，先配制成一定浓度的母液，方便保存和操作3、 实验用品各种试剂天平、高压灭菌锅、电炉、烧杯、pH试纸、容量瓶、量筒、移液管4、 实验步骤1、配制几种母液（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。分别称取名称重量名称重量NH4NO3165gKH2PO417gKNO3190gCaCl2·2H2O44gMgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。各自倒入1L试剂瓶

5、中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。依次称取（注：溶好一个后，再加下一个） 名称重量名称重量KI0.083gNa2MoO4·2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4·5H2O0.0025gMnSO4·H2O1.69gCoCl2·6H2O0.0025gZnSO4·7H2O0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。注：CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。分别称取CuSO4·5H2O

6、 0.05g，CoCl2·6H2O 0.05g，各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）名称重量名称重量肌醇10g盐酸硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。（4）激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。2

7、、配制培养基以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：1）. 先在烧杯中放入一些蒸馏水。2）. 分别取上面八种母液10ml倒入。3）. 一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。4）. 加蒸馏水用量筒定溶至1L。5）. 按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。6

8、）. 称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。7）. 稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。8）. 放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。实验三 植物组织培养（外植体的处理与愈伤组织的诱导）（开放） 一、实验目的 了解植物组织培养的基本原理，掌握培养基配制和消毒、植物材料的处理、接种等基本技术。二、实验原理 植物细胞的全能性三、实验用品 器材：超净工作台、培养架、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿。 试剂：20%次氯

9、酸钠、70%酒精、无菌水、培养基母液。 材料：菊花的茎段与叶片四、实验步骤1、培养基配置： 诱导愈伤组织的培养基为：2,4-D0.5mg/l+NAA0.5-1mg/l+6-BA2mg/l+水解乳蛋白500mg/l 3%蔗糖+0.8%琼脂（金盏菊）,pH 5.8。2、叶片的消毒： 取幼嫩叶片用自来水充分洗净后，经75%酒精消毒30s, 20%次氯酸钠溶液浸泡8min，无菌水冲洗5-6次后，去掉主叶脉和大的侧叶脉，将叶片切成1.0-1.5cm2的小方块。3、接种：用75%酒精擦洗接种台表面，解除三角瓶上捆扎的线绳，有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排

10、列在接种台左侧，然后轻轻打开封口膜，将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌，同时把长镊子也放在火焰上方灼烧，将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的外植体，然后将培养皿打开一小缝，用镊子取出处理好的叶片，背面朝下放到培养基表面。在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌。然后用封口膜封口，待所有人完成实验后，将其放入培养箱内进行培养，在培养箱内，分班做好标记（标记内容包括：班级名称、接种日期、接种数量、培养基类型等）。4、注意事项：消毒以后的所有操作过程，都应在超净工作台上进行，操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中，使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻，冷却后再切割。注意：（1）

11、从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。（2）外植体要选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见表1。（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。且操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。（4）接种前培养基出现大量污染现象要区分原因。（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀，主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台出现故障

12、等原因引起。应保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。五

13、、实验结果接种后污染调查观察接种后第天的污染情况，填入下表： 接种日期培养基种类接种数污染率生长情况表1 植物组织培养中常用的消毒剂消毒剂名称使用浓度（%）去残留难易灭菌时间（min）消毒效果乙醇7075易0.13好氯化汞0.10.2较难215最好漂白粉饱和溶液易530很好次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好过氧化氢1012最易515好 六、思考题1、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？有时候会在消毒溶液中加入12滴的表面活性物质，例如吐温80或吐温20，为什么？消毒水都具有很强的烧蚀性,在杀灭细菌的同时,也会作用于正常的细胞组织,影响正常细胞的成长或再生,所以外植体消毒后

14、一般要用无菌水漂洗，以清除残留的具有杀伤力的消毒剂。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。2、 在接种过程中，通过哪些措施防止细菌对接种工具接种材料的污染？认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌操作人员严格遵守无菌操作规程培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量在培养基中加入适量的抗生素利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长减少培养基中的某些有机成分，可抑制微生物的生长繁殖 实验四 细胞膜的渗透性一、实验目的

15、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。2、 实验原理1溶血现象可作为物质是否进入红细胞及测量物质进入红细胞速度的指标。2红细胞置于等渗溶液中，溶质分子进入细胞，使细胞内渗透活性分子的浓度改变，继而导致水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生溶血。3不同溶质分子进入细胞膜的速度不同，发生溶血所需的时间也不同。4红细胞的溶血时间与溶质分子的极性、分子大小有关；同时细胞膜对进入细胞分子的选择性也对溶血现象的发生起重要作用。 3、 实验用品材料：抗凝鸡血器材：小烧杯、试管及试管架、移液管实验试剂0.17 mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化铵，0.17 mol/L醋酸氨，0.17 mol/L硝

16、酸钠，0.12 mol/L硫酸钠，0.12 mol/L草酸铵，0.32 mol/L葡萄糖，0.32 mol/L甘油，0.32 mol/L乙醇，0.32 mol/L丙酮，蒸馏水4、 实验步骤1血细胞悬液的制备取1mL抗凝全血于50mL小烧杯中，再加入9mL 0.17 mol/L氯化钠，配置好稀释的血细胞悬液。2溶血现象观察-对照取试管1支，加入mL蒸馏水，然后再加入. mL稀释的鸡血，注意观察溶液的颜色变化，溶液由不透明的红色变为红色透明，红细胞发生破裂，造成所有红细胞溶血，使光线容易通过。显微镜下观察溶血前后红细胞的形态。3观察红细胞对各类物质的渗透性:取试管10支，分别加入上述10种溶液各5

17、 mL，再 加入0.5mL稀释的鸡血，记下时间，轻轻摇动使混匀，注意是否发生溶血；若发生溶血，记录溶血过程所需的时间 。5、 实验结果水乙醇丙酮甘油醋酸氨草酸铵氯化铵氯化钠、硝酸钠、硫酸钠、葡萄糖1ml水+0.1ml红细胞悬液：水使红细胞发生溶血的时间最短，几乎是瞬时的。在低渗条件下，大量水分子从水通道易化扩散进入红细胞，从而引起了迅速的红细胞溶血现象。1ml0.32M乙醇+0.1ml红细胞悬液：乙醇是脂溶性小分子，可以自由扩散进出细胞。实验中，红细胞外有相对高浓度的乙醇，大量乙醇分子顺浓度差进入红细胞，使红细胞内渗透压高于红细胞外渗透压，水通道开放，大量水分子进入红细胞，发生溶血。1ml0.

18、32M甘油+0.1ml红细胞悬液：甘油进入红细胞引起溶血的机制与乙醇相同，但其引起溶血的时间稍长，是由于甘油极性相对比乙醇高，脂溶性相对比乙醇低，且分子量比乙醇高，进入红细胞的速度比乙醇慢，红细胞内液达到使水通道开放的渗透压时间长。1mL0.12M草酸铵+0.1mL红细胞悬液：铵盐为弱电解质，溶液中存在电离平衡，有许多分子形式存在的氨。氨是小分子，可自由扩散进出红细胞。实验中，红细胞外氨浓度相对高，氨分子顺浓度差进入红细胞，使红细胞内渗透压升高，促使水通道开放，大量水分子进入红细胞发生溶血。1mL0.17M氯化铵+0.1mL红细胞悬液：氯化铵引起红细胞溶血的机制与草酸铵引起溶血的机制相同，但其

19、时间比草酸铵长，这是由于二者虽然均为等渗溶液，但铵离子含量不同。氯化铵中铵离子含量少（几乎少了一半），相应地氨分子含量也少，因此氨分子进入红细胞的速率也慢，引起溶血的时间就长（近似长了一倍）。1mL0.17M氯化钠+0.1mL红细胞悬液/1mL0.12M硫酸钠+0.1mL红细胞悬液： 钠离子在溶液中完全电离，不存在分子形式。钠离子是通过细胞膜上的选择性离子通道进入细胞的，由离子通道介导的易化扩散是顺浓度梯度或电化学梯度的。等渗的钠盐溶液不能引起红细胞膜上的离子通道开放，因而钠离子无法进入红细胞，红细胞内渗透压不会升高，因而水分子不会进入红细胞，不会发生溶血。1mL葡萄糖+0.1mL红细胞悬液：

20、红细胞摄取葡萄糖的方式是载体介导的易化扩散。实验中，葡萄糖顺浓度梯度进入红细胞，但随后很快被红细胞代谢，为红细胞提供能量，不会引起红细胞内渗透压的显著升高。因此，等渗的葡萄糖溶液不会使红细胞发生溶血。6、 思考题1.推断下列溶液的溶血反应会如何，并做实验证实。 0.17 mol/L氯化钾、0.17 molL硝酸钾、 0.12molL氯化镁、0.12 molL氯化钙、0.10 molL硫酸钾、0.10molL醋酸钾、0.10mol/L 柠檬酸钠、0.32 molL甘露醇、0.32mol/L 蔗糖。 溶血：0.10molL醋酸钾不溶血：0.17 mol/L氯化钾、0.17 molL硝酸钾、 0.1

21、2molL氯化镁、0.12 molL氯化钙、0.10 molL硫酸钾、0.10mol/L 柠檬酸钠、0.32 molL甘露醇、0.32mol/L 蔗糖 2.溶液的渗透压主要与哪些因素有关?对简单盐 溶液如何粗略计算出其渗透压?渗透压与溶液中不能通过半透膜的微粒数目和环境温度有关。在温度一定时，稀溶液的渗透压力与溶液的浓度成正比；在浓度一定时，稀溶液的渗透压力与热力学温度成正比。难挥发非电解质稀溶液的渗透压力与溶液浓度和热力学温度的关系为：=CRTc为摩尔浓度，单位：mol/L，也可以算作C=n/V（物质的量(mol)/体积(L)），R为理想气体常数，当的单位为Pa，V的单位为升（L）时，R值为

22、8.314J·K-1·mol-1，T为热量，单位：K（开尔文），与摄氏度的换算关系是 T(K) = 273+T(C)。实验五 叶绿体的分离和荧光观察1、 实验目的1 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理与方法；了解差速离心特点与用途；2 了解荧光显微镜的原理，掌握荧光显微镜的操作，观察白菜叶绿体的形态、分布与数量。2、 实验原理采用差速离心分离细胞器；沉降顺序：核叶绿体线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体；叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。白菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察 其形态和分布；三、实验用品1器材：离心机、研钵或组织捣碎机、显微

23、镜、天平、离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片2材料：新鲜白菜叶3试剂：0.35mol/L氯化钠溶液 ，0.01%丫啶橙四、实验步骤（一）叶绿体的分离与观察取新嫩白菜叶，洗净檫干、去梗，称30g，分批放入研钵。加入0.35mol/L氯化钠溶液， 共150ml，研磨，制成匀浆；将匀浆用层纱布过滤于烧杯中；取滤液ml在1000r/min离心min，取上清；上清液3000r/min离心min去上清，沉淀即为叶绿体；加0.35mol/L氯化钠溶液悬浮沉淀；取叶绿体悬液滴于载玻片上，加盖片：普通光镜下观察；加0.01%丫啶橙,荧光显微镜下演示,（二）白菜叶徒手切片观察新嫩白菜叶斜切面片，0.3

24、5mol/L氯化钠溶液滴；加盖片轻压：光镜下观察叶绿体在表皮细胞和保卫细胞中的分布；加0.01%丫啶橙,荧光显微镜下演示。五、实验结果绘图：菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿体。六、思考题简述：叶绿体的分离原理和方法（见实验原理、步骤）使用荧光显微镜时应注意：1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。2放置标本片，调焦后即可观察；3高压汞灯关闭后不能立即重新打开，至少需经5min后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。实验六 动物细胞原代培养一、实验目的1高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。2如果把活细胞拿到体

25、外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。3高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 二、实验原理原代培养 （primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。三、实验用品器材：倒置显微镜、镊子、剪刀、烧杯、培养皿、 锥瓶、培养瓶、胶塞、移液管、EP管试剂：1640培养基、hanks

26、液、胰酶、双抗材料：小鼠1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 5毫升移液器, 1640培养基30毫升(方瓶，2人共用） 、 Hanks液20毫升（圆瓶，2人共用）；2.饭盒1个,枪头4支抗 菌 素 的 使 用抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成1640基础培养基 95血清 5碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位毫升四、实验步骤1取小鼠

27、，用颈椎脱臼法处死.然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），台面消毒，取出动物消毒。2戴无菌袖套.点燃酒精灯，手部消毒。3在无菌操作台内将胎鼠外表再次消毒。4将腹部剪开，取出肝脏。5 Hanks液培养皿A，B。(大镊子夹瓶塞，用吸管吸取)6小镊挑出肝脏 A清洗,剪去其它组织与器官等。7将材料转入B再次清洗;8 A换Hanks，材料再于A中漂洗;9剪取1/51/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成0.51mm3碎块。10将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯,合入锥瓶,迅速摇匀;11锥瓶加塞,覆口,拿出工作台

28、,于37 水浴锅中消化57分钟(严格)!,中间摇动23次;12于超净工作台中加入45ml培养基,终止消化.用吸管充分吹打78次;13将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!)用培养基清洗纱布2次,每次34ml;14分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积5ml;15培养瓶加塞, 侧面标记。 37 培养.16明天来观察细胞,并进行细胞传代.注 意清理台面,用品洗净,交回.细胞培养的结果观察与鉴定肉眼观察显微镜观察污染细菌黄、混大量小粒、杆霉菌霉斑大量菌丝未污染未生长红、清组织边缘无迁移生长黄、清、生长晕、连片铺瓶组织边缘细胞迁移、细胞长

29、梭形、连片 其他说明1霉菌一般红、清，初期只有菌丝，没有霉斑。2放线菌、酵母菌污染。3细胞初期呈三角形，后呈长梭形。4胞体大而透明，说明生长情况良好，反之，则说明培养条件不佳或细胞已经衰老。5黄、清培养基的更换。实验七 液泡系的超活染色与观察一、实验目的1 观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、发育和分布；2 了解细胞和细胞器的超活染色技术 二、实验原理1线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，具形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态面发生变化。 2詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染性，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态

30、)，呈蓝绿色：而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。3中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。 三、实验用品1 器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2 试剂：Ringer液、1/5000詹纳斯绿、1/3000中性红3 材料：人口腔上皮细胞、蚕豆幼根根尖四、实验步骤（一）线粒体的超活染色与观察1 口腔上皮细胞线粒体的超活染色（1）取清洁载玻片放在37恒温水溶锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。（2）实验者用牙签

31、宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10-15min(注意染液不可干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。（3）在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。（二） 蚕豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察（1）实验前，把蚕豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使具发芽，胚根伸长到lcm以上（2）用双面刀得把初生的蚕豆幼苗根尖(1-2cm)小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色5一10min。（

32、3）吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。（4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成热区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。注：活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构。而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究

33、生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通过把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作

34、为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus peen B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。液泡系是指由内膜所包围的小泡和液泡，除线粒体和质体外，都属于液泡系。液泡的类型可分为以下几种：高尔基液泡，溶酶体，圆球体（植物细胞所特有），微体，自噬小体，吞噬泡，胞饮液泡，糊粉粒（植物的种子中产生的一种特异的液泡），收缩泡，动、植物液泡都是由一层单位膜包围而成。

35、实验八、九 巨噬细胞吞噬现象的观察一、实验目的1了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理2熟悉细胞吞噬作用的基本过程二、实验原理1在高等动物中，单核吞噬细胞系统和嗜中性粒细胞专司吞噬功能，在细胞的非特异性免疫功能中发挥重要作用。单核吞噬系统包括血液中的单核细胞和组织中固定和游走的巨噬细胞。2但静息的巨噬细胞其分泌和杀伤功能低下，受到病原微生物或炎症因子的刺激时，巨噬细胞成为激发或致敏状态，分泌能力得以增强，但杀伤功能仍然很低。只有活化的巨噬细胞才具有较强的吞噬能力，具有非特异抗感染和抗肿瘤作用。 3大吞噬细胞来源：单核巨噬细胞存在部位：血液（单核细胞)，全身结缔组织及小血管的基底 膜组织（巨噬细胞）

36、功能：吞噬病原微生物（寄生虫等），死亡细胞。4小吞噬细胞来源： 中性粒细胞存在部位： 血液 、 炎症部位（全身）功能：主要吞噬化脓菌三、实验用品1器材：显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水纸2试剂：生理盐水、Alsever溶液、瑞氏染液3材料：小白鼠、1%鸡血红细胞。四、实验步骤实验前3天取小白鼠腹腔注射6淀粉液1毫升（连续注射三天效果较好）。1小鼠腹腔注射1的鸡红细胞悬液2ml，轻揉腹部使鸡细胞分散。2 2530分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠。并腹腔注射生理盐水2毫升3.在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，向其中滴加一滴腹腔液，静置10分钟，腹腔巨噬细胞贴壁，弃去生理盐

37、水，待其标本稍干后瑞氏染液染色。4.瑞氏染色：滴加34滴瑞氏染液于标本上，以完全盖住标本为宜。5分钟后甩去玻片上的染液，自来水轻洗，吸水纸吸干。干燥后油镜镜检5. 清洗油镜，解剖盘及器具，打扫桌面卫生、实验室卫生，老鼠尸体要掩埋！思考题1.在高等动物中哪些细胞具有吞噬功能？白细胞（分为：淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和单核细胞) 吞噬细胞 （包括大吞噬细胞和小吞噬细胞，大吞噬细胞即单核-巨噬细胞，细胞小吞噬细胞即中性粒细胞。）2.在什么情况下巨噬细胞吞噬功能加强？受到病原微生物或炎症因子的刺激时，巨噬细胞成为激发或致敏状态，分泌能力得以增强，但杀伤功能仍然很低。只有活化的巨噬

38、细胞才具有较强的吞噬能力，具有非特异抗感染和抗肿瘤作用。实验十、 细胞中酸性磷酸酶的定位一、实验目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤。 2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。二、实验原理1 酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。正常条件下,巨噬细胞处于休止状态,酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化， 如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性底物可以渗入,酶活力被显示。2 通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。但因其是无色的，

39、需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布。反应如下：-甘油磷酸钠- 甘油 +PO4 3-PO43-+Pb(NO3)2 -Pb3(PO4)2（沉淀）Pb3(PO4)2 +(NH4)2S-PbS (棕黑色)三、实验用品1.材料：小白鼠2.试剂：1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙 10ml,蒸馏水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地滴加3% -甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存) 。 3)2硫化铵溶液：硫酸

40、铵2毫升98毫升水。4)0.05molL乙酸缓冲液。A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml 。 B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O 2.72g加蒸馏水至00毫升。取A液毫升B液70毫升蒸馏水300毫升。6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性淀粉.0g，蒸馏水00ml，煮沸灭菌，保存，使用时热水浴融化。3.仪器、 用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。四、实验步骤.前处理 （）小白鼠每日腹腔注射淀粉肉汤ml，连续注射天 （）在第天,再向腹腔注射ml生理盐水，过min用颈椎脱臼法

41、处死小鼠，剖开腹腔，把内脏推向一侧，用不带针头的注射器或吸管吸取腹腔液.制片1）.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开，自然干燥。2）.放入作用液中，37 保温30min 。3）.蒸馏水漂洗片刻。4）.放入甲醛钙固定液中固定5min 。5）.蒸馏水漂洗片刻。6）.放入2%硫化铵液3-5min 。7).蒸馏水漂洗,镜检。3.对照实验:标本放入作用液前先用高温（50）处理30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上3)-7)步。五、实验结果与分析巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。实验中的

42、注意事项：1.铅离子的浓度，作用时间作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象2.腹腔注射1.小鼠腹腔注射可以用5ml的注射器，配合5.57号针头。2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官。3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进

43、针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔。3.小鼠的处死脊柱脱臼法 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，瞬间死亡 。 皮肤和腹膜要分别剪开，并确保皮肤血液 不流入腹腔。腹腔内的冲洗液要全部吸干。相关理论知识：1巨噬细胞（M）发育：骨髓多能干细胞定向干细胞（髓样干细胞）单核母细胞前体单核细胞单核细胞血液组织（分化为巨噬细胞）2 M分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎存在于所有表皮和黏膜下组织。3 M形态：有伪足，马蹄状单核，细胞形体大。4 M分离纯化：小鼠和大鼠腹腔内有丰富的巨噬细胞，可用腹腔清洗的方法获得较多细胞悬液。正常小鼠每只可收

44、集腹腔渗出细胞106，其中30%为巨噬细胞，如果给小鼠腹腔注射某种刺激物，可使巨噬细胞渗出增加，易于分离更多的巨噬细胞。5在高等动物中存在大小两类吞噬细胞（巨噬细胞和嗜中性粒细胞），专司吞噬作用，在细胞的非特异免疫功能中发挥重要作用。.单核细胞 单核细胞来自骨髓的前单核细胞，发育成熟后释放到血液中。血液中单核细胞已向全身各组织并进一步分化成各种组织的巨噬细胞。血液中单核细胞为圆形或椭圆形，直径14-20微米，在形态上很难和其他独核细胞相区分。胞质中含有嗜天青颗粒，它是一种溶酶体，其中含有过氧化物酶，酸性磷酸酶，非特异性酯酶和溶菌酶等，这些酶与单核细胞的杀伤和消化功能有关。单核吞噬细胞在血液中约

45、占白细胞的1%-3%，其在血液中的半衰期约为8-10个小时，一旦进入组织分化为巨噬细胞后，其生命周期可长达数月至数年。.巨噬细胞的特性 组织中的巨噬细胞则呈显著的多形性，在培养条件下对塑料或玻璃表面具有极强的粘附性，一次可利用这一特性分离巨噬细胞并与非粘附性细胞分开，但其作用机制不详。巨噬细胞在体内可借其表面粘附分子与其它细胞或细胞外基质黏附在一起。巨噬细胞的另一特性是对异物通过不同机制具有吞噬作用（phagocytosis）,吞饮（endocytosis）或胞饮作用（pinocytosis）。可将异物吞入胞内，并借其胞浆内的大量液泡及颗粒中的内含物和代谢产物将吞入的异物降解，消化和清除。思考

46、题1在制片的过程中为什么要采用冷冻涂片？可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。2简述巨噬细胞（M）发育及M分布？巨噬细胞（M）发育：骨髓多能干细胞定向干细胞（髓样干细胞）单核母细胞前体单核细胞单核细胞血液组织（分化为巨噬细胞）M分布：单核细胞主要于血液中，巨噬细胞几乎存在于所有表皮和黏膜下组织。实验十一、十二 玉米成熟胚培养一、实验目的1学习掌握成熟胚培养方法。2玉米的组织培养，特别是胚性细胞系的建立，作为遗传转化操作的主要技术基础，一直受到广泛关注。前人已采用过玉米的多个部分如根、茎、叶、幼穗、幼胚和成熟胚等为外植体，研究了其愈伤组织细胞的分化再生情况，发现幼穗和幼胚愈

47、伤组织具有较高的再分化能力。但幼穗，幼胚的采用受季节限制，而种子保存期长，易获得，可用于较长时间的研究。只是成熟胚脱分化能力较弱，愈伤组织再分化能力差，但如果能改变种子的生理状态，提高其胚性愈伤组织的形成能力，无疑将大大促进小麦胚性细胞系的建立。低温处理具有促进种子从体眠状态转向萌发状态的效应。低温处理对玉米成熟胚愈伤组织的形成也有一定影响，可以提高其愈伤形成和分化能力。二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶。三、实验药品MS培养基母液、2,4-D、6-BA、KT、吲哚乙酸(IAA)、腺嘌呤、天冬氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂。四、实验步骤1、培养基的制备诱导培养基：

48、MS+ 2 ,4-D2 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。继代培养基：MS+ 2 ,4-D1 mg/ L + KT0.5 mg/ L+水解酪蛋白300 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。分化培养基：MS+6-BA 2m g/l+水解酪蛋白500 mg/ L +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。小苗培养基:MS +NAA0.2m g/1+腺嘌呤40m g/l+蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。生根壮苗培养基：1/2 MS +NAA0.5m g/1 +蔗糖3%+琼脂0.8%，pH5.8。2、无菌材料的获得将玉米种子在4冰箱中充分吸水，用0.1% HgCl2灭菌20min，无菌