基因工程的基本步骤教学提纲

1、基因工程的基本步骤1.21.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目标引领：目标引领：1 1、能说出基因工程基本操作程序的四个步骤、能说出基因工程基本操作程序的四个步骤2 2、能准确描述获取目的基因的方法、能准确描述获取目的基因的方法3 3、能说出基因表达载体的具体元件、能说出基因表达载体的具体元件独立自学：阅读教材独立自学：阅读教材P10-15思考：思考：1 1、何为、何为转化转化？将目的基因导入不同受体细胞的方法？将目的基因导入不同受体细胞的方法 一样吗？请举例说明一样吗？请举例说明2 2、如何确定、如何确定转化成功转化成功？需要确认那些信息？用什么？需要确认那些信息？用什么 具体

2、的方法？具体的方法？引导探究：引导探究：1 1、农杆菌有何特点，农杆菌转化法的、农杆菌有何特点，农杆菌转化法的原理是什么原理是什么？用？用 文字和箭头写出具体过程文字和箭头写出具体过程2 2、根据农杆菌可以将目的基因导入双子叶植物的机理，、根据农杆菌可以将目的基因导入双子叶植物的机理，你能否设计一个方案将一个抗病基因导入单子叶植物你能否设计一个方案将一个抗病基因导入单子叶植物中？中？3 3、请用文字和箭头写出显微注射法的、请用文字和箭头写出显微注射法的具体过程具体过程4 4、作为受体生物原核生物有何优点？请用文字和箭、作为受体生物原核生物有何优点？请用文字和箭头写出目的基因导入原核细胞的头写出

3、目的基因导入原核细胞的具体过程具体过程5 5、请具体描述各种检测和鉴定方法的、请具体描述各种检测和鉴定方法的具体操作过程具体操作过程归纳: 基因工程的基本操作程序n 获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成n 构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因n 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法n 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：抗虫性、抗病性等鉴定：

4、抗虫性、抗病性等目标升华目标升华1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物物的基因在另一种生物中的转化。中的转化。

5、才能确定目的基因是否才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。遗传和正确表达。一、目的基因的获取一、目的基因的获取（一）、目的基因主要是（一）、目的基因主要是_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成1、从基因文库中直接获取、从基因文库中直接获取（1 1）基因文库：）基因文库：概念见概念见P9P9（2 2）基因文库的分类）基因文库的分类: :按外源按外源DNADNA片段的

6、来源分类片段的来源分类种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文库文库提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库（3 3）基因文库的构建方法）基因文库的构建方法1 1、直接分离法、直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNAD

7、NA双链双链cDNAcDNA片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶2 2、反转录法：、反转录法：cDNAcDNA的合成流程图解的合成流程图解（4 4）两种基因文库的区别）两种基因文库的区别 过程过程高温变性（高温变性（解旋为单链解旋为单链）低温退火（低温退火（引物与单链互补结合引物与单链互补结合）适温延伸（适温延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链双链）重复循环重复循环预变性（预变性（增加增加DNADNA变性的概率变性的概率）2 2、利用、利用

8、PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(dNTP)(dNTP) 引物：引物：热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 缓冲溶液缓冲溶液寡核苷酸序列：与目的基因的起寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补始段互补3 3、人工合成的目的基因、人工合成的目的基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表

9、达和发挥作用。基因能够表达和发挥作用。2 2、基因表达载体的组成：、基因表达载体的组成：复制原点复制原点+ +目的基因目的基因+ +启动子启动子+ +终止子终止子+ +标记基因标记基因启动子：启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能位，有了它才能驱动基因转驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，能终能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作

10、用是为了为了鉴别鉴别受体细胞中是否含有目的基受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细因，从而将有目的基因的细胞筛选出来胞筛选出来载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二

11、酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： （二）方法（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细

12、胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）分子杂交（注意与上不同之处）抗原抗体杂交抗原抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功1 1、将目的基因导入植物

13、细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点优点2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动

14、物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.将含目的基因的将含目的基因的DNA片段用放射性同位素片段用放射性同位素等作标记等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明目的基因已插入染色体表明目的基因已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:（二）、鉴定（个体生物学水平）