水中细菌总数测定

1、水中的细菌总数测定 1.培养基的配制2.消毒与灭菌3.水中细菌总数的测定4.菌落计数法（一）实验目的（一）实验目的（二）实验原理（二）实验原理（三）实验器材（三）实验器材（四）实验方法（四）实验方法（五）实验作业（五）实验作业（一）实验目的（一）实验目的1 1、明确培养基的配制原则；、明确培养基的配制原则；2 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；、掌握配制培养基的一般方法和步骤；3 3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；4 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。方法。（二）实验原理（二）实验原理 培养

2、基培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基制合适的培养基. . 培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物培养基的种类繁多，根据培养基的

3、成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。体培养基。常用加热灭菌法常用加热灭菌法：1 1、干热灭菌：、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌2 2、湿热灭菌、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法间歇灭菌法 煮沸消毒法煮沸消毒法 灭菌灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多

4、，可分为加热、过滤、照子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。射和化学药品法等。（三）实验器材（三）实验器材1.药品和试剂：药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、1010NaOHNaOH溶液、溶液、1010盐酸溶液。盐酸溶液。2.器材：器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PHPH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。棉花、线绳、干燥箱、高压锅。1.1.称量称量按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏

5、配方：牛肉膏5.0g,5.0g,蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，NaCl5.0g,NaCl5.0g,琼脂琼脂20.0g,20.0g,蒸馏水蒸馏水1000ml,pH7.01000ml,pH7.0。（四）实验方法（四）实验方法 培养基的制备过程培养基的制备过程称量称量-溶解溶解-调节调节pHpH值值-过滤过滤- -分装及包扎分装及包扎-灭菌灭菌-灭菌后试管灭菌后试管摆放斜面摆放斜面2.2.溶解溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使

6、培养基溢程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 3.3.调节调节pHpH值值用玻璃棒沾少许液体，测量用玻璃棒沾少许液体，测量PHPH值。用氢氧化钠和值。用氢氧化钠和盐酸调节盐酸调节PHPH。4.4.过滤过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。去。5.5.分装及包扎分装及包扎根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。

7、塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6.6.灭菌：灭菌：高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌，1211210 0C C灭菌灭菌2020分钟。分钟。7. 灭菌后试管摆放斜面灭菌后试管摆放斜面注注 意意 事事 项项1 1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2 2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2 2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，

8、此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 4 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的的1/51/5，液体培养基的装量约为管高的，液体培养基的装量约为管高的1/41/4，三角瓶的装量不超过瓶体，三角瓶的装量不超过瓶体的的1/2 1/2 ； 5 5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。而引起污染。返返 回回（五）实验作业（五）实验作业为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？为什么湿热

9、灭菌比干热灭菌法更有效？消毒与灭菌消毒与灭菌 1干热灭菌法干热灭菌法 2高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 3紫外线灭菌法紫外线灭菌法（二）（二）高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 1、原理、原理 利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。质凝固变性而达到灭菌的目的。 一般培养基用一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530

10、min 2、步骤、步骤加水加水装待灭装待灭菌物品菌物品加盖加盖加热加热灭菌时间到后灭菌时间到后断电源断电源压力降为零压力降为零开箱取物开箱取物（三）紫外线灭菌法（三）紫外线灭菌法1 1、原理、原理 紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和腺嘧啶二聚体的形成和DNA DNA 链的交联，从而链的交联，从而抑制了抑制了DNA DNA 的复制。另一方面，由于辐射能的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成使空气中的氧电离成OO，再使，再使O O2 2 氧化生成氧化生成臭氧或使水氧化生成臭氧或使水氧化生成H H2 2O O2 2。O O3 3 和和H

11、H2 2O O2 2 均有均有杀菌作用。杀菌作用。 适用于无菌室，接种箱，手术室内的空适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。气及物体表面的灭菌。2 2、步骤、步骤 1 1）单用紫外灯）单用紫外灯 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射灯开关，照射30min30min，将开关关闭。，将开关关闭。 2 2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用）化学消毒剂与紫外线照射结合使用 在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，再用紫外线灯照射再用紫外线灯照射15imn15imn水中细菌总数测定水中细菌总数测定一、水样的采集一、水样的采

12、集 1. 采水容器采水容器 采样瓶：具磨口玻塞的采样瓶：具磨口玻塞的500mL广口瓶广口瓶 采样瓶的洗涤采样瓶的洗涤 采样瓶的灭菌采样瓶的灭菌: 160170干热灭菌干热灭菌2h，或用高压蒸汽，或用高压蒸汽灭菌器，灭菌器，121灭菌灭菌15min一、水样的采集一、水样的采集2. 采样步骤及注意事项采样步骤及注意事项 (1)去氯和高浓度重金属：灭菌前按去氯和高浓度重金属：灭菌前按500mL采样瓶加入采样瓶加入0.3mL10%Na2S2O3溶液溶液 (2) 采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带塞采样瓶插入水中，约距水面将已

13、灭菌的带塞采样瓶插入水中，约距水面1015cm处采集处采集 （3）采集一定深度的水样时，可使用单层采水器或深层采水器）采集一定深度的水样时，可使用单层采水器或深层采水器 （4）从自来水龙头采集样品时，采水前可先将水龙头打开至最）从自来水龙头采集样品时，采水前可先将水龙头打开至最大，放水大，放水35min，用酒精灯火焰灼烧约，用酒精灯火焰灼烧约3min灭菌灭菌 （5）在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免）在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰；同一采样点与理化监测项目同时采样时，应不同层次的搅扰；同一采样点与理化监测项目同时采样时，应先采集细菌学检验样品先采集

14、细菌学检验样品 （6）采样完毕，做好记录）采样完毕，做好记录 二、样品保存二、样品保存 采好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学采好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学检验。一般从取样到检验不宜超过检验。一般从取样到检验不宜超过2h，否则应，否则应使用使用10以下的冷藏设备保存样品，但不得超以下的冷藏设备保存样品，但不得超过过6h 细菌总数的测定 细菌总数：指细菌总数：指lmL水样在营养琼脂培养基中，于水样在营养琼脂培养基中，于37培养培养24h后，所生长细菌菌落的总数后，所生长细菌菌落的总数。 一、细菌总数测定的意义一、细菌总数测定的意义 可以反映水体有机污染的程度可以反映水体有机污染的程度 生活饮用水的细菌总数生活饮用水的细菌总数lmL不得超过不得超过100个个 细菌总数的测定二、培养基的制作二、培养基的制作 三、测定方法及步骤三、测定方法及步骤 1.稀释水样稀释水样2.接种水样接种水样3.培养：培养：37下倒置培养下倒置培养24h24h 细菌总数的测定水样225mL无菌水25mL1mL1mLckck10-110-110-210-210-310-31mL1mL1mL1mL1mL1mL三、菌落计数三、菌落计数 3724h 细菌总数的测定例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总