微生物的遗传物质

1、会计学1微生物的遗传物质微生物的遗传物质第一节证明遗传物质是DNA（RNA）的三个经典试验1、细菌的转化实验1928, 英国Griffith, Streptococcus penumoniae菌株毒力荚膜菌落野生型有产生光滑Smooth突变型无不产生粗糙RoughGriffith认为,加热杀死的S型菌中存在某种能使活的R型菌转变成S型菌的因子,并把此因子称为转化因子.这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状,或发生遗传性状改变的现象叫做转化.结论:转化因子是DNAAvery等的转化实验2、噬菌体感染实验1952，Hershey & Chase, T2噬菌体结论：

2、在感染过程中，噬菌体的DNA进入细菌细胞中，它的蛋白质外壳并不进入细胞中去。推论：决定T2噬菌体的蛋白质外壳的遗传信息的携带者是DNA3、病毒重建实验1956，Fraenkel-Corat, Tobacco mosaic virus, TMVTMV protein TMV RNA S protein+HR RNASHRS RNA+HR protein结论：RNA是TMV的遗传物质一、DNA的结构4种脱氧核苷酸由3 5磷酸二酯键聚合而形成DNA的碱基顺序一级结构二级结构DNA Double Helix DNA Double Helix modelmodelWatson & Crick,

3、19533.4nm1nmB-DNA是在有碱金属存在及92%湿度条件下,经X光衍射分析得到的.A-DNA是在75%湿度条件下 DNA纤维通过X光衍射分析得到的.右手双螺旋结构1979年,发现了左手双螺旋DNA,称为Z-DNA是由两条反向平行的多聚核苷酸相连而成的. Z-DNA可能在基因表达调控中起作用,但确切的生物学功能尚待研究.三级结构E. coli 的染色体长度1mm,比其细胞本身长1000倍,所以一定存在着超螺旋结构;在真核生物中核小体的形成引入负超螺旋,在细菌和古细菌中是DNA回旋酶引起超螺旋.DNA的不同形式有： 环状和线状 通常细菌的染色体DNA，质粒DNA，以及真核生物的线粒体DN

4、A和叶绿体DNA为环状 二、二、DNA的复制特点的复制特点和几种主要的复制方式和几种主要的复制方式1. 基本概念基本概念2. 复制起点与方向复制起点与方向 3. Semi-Conservation Replication 4. 复制的方式复制的方式 1. 基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) Watson & Crick:Watson & Crick: 一种遗传物质，必须能行使两种 功能，即自我复制和对细胞的高 度特异性的影响遗传物质的基本属性遗传物质的基本属性：基因的自我复制基因的自我复制 基因的突变可以控制性状的表达基因的突变可以控制性状的表达DNA复

5、制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 每单链每单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTP,dNTP, 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 Replicon; Replicon; Replisome; 每一个复制起点及其复制区称为一个复制单位每一个复制起点及其复制区称为一个复制单位 The multi protein (30The multi protein (30)

6、structure that assembles ) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA at replicating fork to undertake synthesis of DNA 复制机理的复杂性复制机理的复杂性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求能量的供求构型的变化构型的变化 超螺旋超螺旋线状，开环状线状，开环状多种酶类的互作多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制起始控制机理知之甚少复制的准确性复制的准确性 （修复，校正）（修复，校

7、正）研究试材的特殊性研究试材的特殊性（温度敏感型（温度敏感型ts，突变抑制体系，突变抑制体系Su）DNA复制速度复制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋，高速解旋 112 km/h ?)缺乏统一的模式缺乏统一的模式 (D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 原核生物的复制起点（Origin of replication ，简称ori）例如，E.coli 的oriC，长度为245bp真核生物多个复制起点，例如酿酒酵母，约有400个复制起点（autonomously replicatory sequence，ARS），每个长度为100-200bp。2. 复

8、制起点与方向复制起点与方向（replication origin & direction ） isolation of ori rich AT & palindromrich AT & palindrom Enzymes binding site Enzymes binding site 300 bp 300 bp in replication origin in replication origin 0f Prokaryote 0f ProkaryoteAT rich复制起点的特征复制起点的特征AT rich真核生物复制起点的研究是以酵母为基础的ARS (automa

9、tic Replication Sequence) 自主复制序列ARS1 (A, B1,B2,B3) A区具有高度保守性 A/TTTTATG/ATTTA/TB区变化较大 “呼吸呼吸现象现象” DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，复制原点处氢键迅速断裂与再生， 导致两条导致两条DNA链不断解链与聚合，链不断解链与聚合， 形成瞬间的单泡状结构的过程。形成瞬间的单泡状结构的过程。 在富含在富含AT的区域内尤为明显的区域内尤为明显 子链子链DNA延伸方向延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end onlyDNA polymerase reacts on the 3

10、end onlyNew DNA elongation from 5 to 3 direction New DNA elongation from 5 to 3 direction 进化中保留进化中保留的深刻的、的深刻的、选择与适应选择与适应的、化学及的、化学及功能的根源功能的根源 5 OHT C AT C A C 5 OH 3ppp OH C+ ppi 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要，因能量

11、的需要， DNA的的5 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0.2M Nacl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5端，而且端，而且 双链双链DNA的的5端碱基配对困难端碱基配对困难 需要其他机制以解脱需要其他机制以解脱 碱基发生错配后的校正碱基发生错配后的校正 费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 3. D

12、NA的半保留复制的半保留复制（Semi-Conservation Replication） Three replication hypotheses(CsCl gradient centrifuge) (CsCl gradient centrifuge) N15 N14 DNADNASemi-Conservation ReplicationM. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.b) 半不连续复制半不连续复制 （semi-discontinuous replicationsemi-discontinuous replication）

13、 后随链后随链前导链前导链533535534. DNA复制的方式复制的方式 (DNA replication model)(DNA replication model) 型复制型复制1963年，Cairns根据E.coli的环状染色体复制的中间产物自显影实验提出的。形状象 “ ”滚环方式滚环方式 D.S. DNA NickElongation rolling合成互补链，形成双链合成互补链，形成双链A蛋白识别起点，产生切口蛋白识别起点，产生切口polIII催化延长正链环化正链环化形成双链结构产生A蛋白,识别复制起点 置换式置换式 或或 D-Loop （Displacement formDispl

14、acement form） D.S. DNA In mitochondrial DNA In mitochondrial DNA also in chloroplasm DNA also in chloroplasm DNA S.S. DNA as template New S.S. DNA Displacement D-Loop重链复制D-环延伸形成D-环轻链开始复制重链复制完成轻链正在复制轻链复制完成封闭新合成链上的缺口80%以上DNARNA蛋白质 环状双链DNA分子存在于细胞内相对集中的区域，成为拟核。无核膜。 习惯上把原核生物的DNA分子也称为染色体。一、原核生物染色体的数目和大小E.

15、coli有1条环状染色体，4.7MbB.subtilis有1条环状染色体，4.2MbAgrobacterium tumefaciens有1条线性染色体，2.1Mb；1条环状染色体，3.0Mb。二、细菌染色体的结构 参与DNA折叠的蛋白质类组蛋白与DNA结合后，帮助DNA进行高度折叠，除类组蛋白外，DNA还与其他蛋白质相结合。如与复制、转录和加工有关的蛋白质结合在一起，这样，其环状染色体DNA以紧密缠绕的、致密的、不规则小体形式存在，该小体即是拟核。电镜下呈圆形或椭圆形。拟核：三、细菌染色体的复制细菌的复制基因与酶类细菌的复制基因与酶类 Initiate genes dna B preprimi

16、ng 300kd 20 copies/cell hexamerRNApol primase for leading S. dna C acts with dnaB 25kddna G primase for lagging S. 60kd 25 (Okazaki fragment ) monomer SSB Binding with S.S.DNA 74kd 300 Prevents from anneal monomer Elongate genes dnaE DNA polymerase III() 140kd 20dnaZ DNA polymerase III() 52kd 20polA

17、 DNA polymerase I 109kd 400polB DNA polymerase II 90-120kd 100 Topoisomerase topA TopI (swivelase)100kdsuperhelix D.S.helixTopoisomerase gyr TopII (gyrase)gyr D.S.helix superhelixCut D.S. DNAATPLigateTopoisomerase rep Relaxed protein (Helicase) D.S. DNA S.S. DNAlig Ligase HDP Helix Di-stabilizing Pr

18、otein No ATPase Binding S. S. DNA decrease Tm Prevents from anneal b) DNA聚合酶聚合酶 （DNA polymerase） ProkaryoteProkaryote I polA 109KD 3-5和5-3外切酶活性 切除RNA引物和参与后随链合成中的缺口填充反应II polB 3-5外切酶活性III 10种不同的亚基组成 核心酶和全酶Top I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)Helix destabilizing pro

19、tein (HDP) DnaB proteinDnaC protein Primase Ung-ase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligase for primosome复复制制体体进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisome进进 化化 中中 形形 成成 了了 灵灵 活活 的的 多多 酶酶 复复 合合 体体 replisome 位于复制叉处的多酶复合体位于复制叉处的多酶复合体完成完成 lagging Strand DNA延伸时延伸时 必须快速从一个冈崎片段移到另一冈崎片段必须快速从一个冈崎片

20、段移到另一冈崎片段 In lagging Strand 多酶系统多酶系统必须完成多次反复的启动与扩展必须完成多次反复的启动与扩展 E.coli 启动启动20004000次的冈崎片段复制次的冈崎片段复制Replisome modelReplisome model复制起点AT丰富DNA识别位点DNA box 5-TTATCCACA-313个富含AT的单核苷酸 5-GATCTNTTNTTTT-3大肠杆菌染色体复制起点oriC 的结构DNA复制过程链的生长原理起始阶段:识别oriC起始阶段:双链分开起始阶段:引物的合成延伸阶段:The termination of DNA replication E.

21、coli (单起点双方向单起点双方向)两复制叉的相遇处具有多个终止位点两复制叉的相遇处具有多个终止位点(不是复制叉简单相遇）不是复制叉简单相遇） terE, D, A terF, C, B (22bp保守区保守区)F BTerminus Utilization Substance（TUS 36kd）CADETer-TUS复合体终止阶段: terE, D, A 仅对反时针方向的复制叉具有终止效应仅对反时针方向的复制叉具有终止效应 terF, B, C 仅对顺时针仅对顺时针方向的复制叉具有终止效应方向的复制叉具有终止效应 F BCADETer-TUS复合体复合体 (Rep. fork trap)终

22、止终止DnaB(螺旋酶螺旋酶)防止防止DNA过度复制过度复制避免出现避免出现DNA多聚体，高拷贝多聚体，高拷贝四、细菌染色体的分离机制原核基因结构:-35,-10区的特征真核基因结构:增强子,外显子,内含子一、基因结构和基因概念overlapping genesplit genepseudogenemovable gene二、基因组学基因组的大小: 病毒103bp 原核生物106bp 真核生物109bp基因组:单倍体细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因Map of the Mycoplasma genitalium genomeMap of the Haemophilus i

23、nfluenzae genome基因组学的发展E. coli 的基因组转录单元:由启动子,结构基因和终止子组成的一段DNA顺序.操纵子:功能上相关联的几个结构基因前后相连,利用一个共同的启动子和终止子,这种转录单元被称为操纵子.X174噬菌体的基因组真核生物的基因组及其特点基因组的分子量大基因组的分子量大真核生物有很多条染色体，一般呈线性真核生物有很多条染色体，一般呈线性核基因组核基因组DNADNA存在于细胞核内存在于细胞核内基因组有大量不编码蛋白质的序列基因组有大量不编码蛋白质的序列真核生物的蛋白质编码基因往往以单拷贝形式存在真核生物的蛋白质编码基因往往以单拷贝形式存在非重复序列（单一序列）

24、中度重复序列高度重复序列（卫星DNA）真核生物基因组中的DNA序列特征:基因家族:真核生物基因组中存在的许多来源相同、结构相似、功能相关的一组基因。基因簇：有些基因家族的成员紧密排列成大段的串联重复单位，定位于染色体上的特殊区域。 DNA 一一 级级 结结 构构 分分 析析 （DNA sequencing ） The Nobel Prize in Chemistry 1980for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acidsFrederick Sanger MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, Great Britain 1918 - 全基因组测序举例 Haemophilus influenzae1. 基本概念基本概念2. 复制起点与方向复制起点与方向 3. Semi-Conservation Replication 4. 复制的方式复制的方式 isolation of ori细菌的复制基因与酶类细菌的复制基因与酶类 Initiate genes dna B prepriming 300kd 20 copies