乳酸菌的培养检测方案

1、品质管理检测项目细菌形态学分类厌氧邸昼.*«. 不饰, 叫胸 尊m桁 布加 MS-KV* 蜥m 丈肯.属 巴«（, ”怦 军团革兰阳性革兰阴性一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本届性：孚L酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。 这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。 利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。无芽抱，革兰氏染色呈阳性。微好氧，厌氧发酵，最适温度3040摄氏度，最适PH值为5.56.2,在微酸环境下可以生长，中性

2、或者偏碱性环境中则生长速率下降。在固体培养 基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：培养基： BCP培养基、MRS培养基和 SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g,蛋白月东5g,葡萄糖5g,漠甲酚紫0.04g,琼脂15g,蒸储水 lO00ml , pH7 0 ;MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重 量（g）牛肉蛋 白粉10 ,鱼肉汁10，酵母浸出汁粉 5，葡萄糖20，醋酸钠5，柠檬酸二铉 2 ,吐 温80 0.1

3、，硫酸镁 0.58，硫酸镒 0.28，蒸溜水 1 000ml，备注：用高压锅在 121C灭菌 15min,调节 pH6.2 6.4 。孚L酸杆菌选择性琼脂 SL：酪蛋白水解物 10g;酵母提取物 5g;柠檬酸二铉 2g;乙酸 钠(CH3COONa ? 3H2O) 25g ; MgSO4 ? 7H2O 0.58g ;琼脂 15g；葡萄糖 20g；吐温 80 1.0ml; 磷酸氢二钾 6g； FeSO4? 7H2O 0.03g ; MnSO4 ? 4H2O 0.15g。以上用量为 1000ml 培养基的 用量。溶解琼脂在 500ml的沸水中，溶解其他组分在 500ml的水中，用冰醋酸调 pH=5.

4、4 , 并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管， 这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。孚L酸杆菌在液体培养基中的生长状况背景资料：培养基有 MRS培 养基、 RS MA 培 养基、 番茄汁琼脂培养基。当乳酸杆菌是待分离区 系的优势菌时，常用MRS培养基对其进行分离。一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌等在 MRS培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离 难度。目前MRS培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。常用于从 乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。番茄汁琼脂培养基，这是一种传统

5、的用于分离乳酸杆菌的培养基，此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。 但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS等培养基所代替。某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道)内进行乳酸杆菌的分离。APT( All Purpose Tween)培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的RogosaSL( Rogosa Sodium Lactate Modified )完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸 杆 菌的分离。Briggs琼脂培养基和s L( Sodium Lactate)培养基常

6、用于酸奶中乳酸杆菌分离。(二) 检测内容、流程、方式：内容：1通过对水体当中的的乳酸杆菌的筛选培养，最后计数得到相应水体当中的乳酸杆菌的数量。方法为：逐级稀释法。2乳酸杆菌的定性流程： 采集：每个采集点各自采集10ml的池塘水，经过过滤杂质(固体)，冷冻运送等环节送到实验室内部。 稀释平板测数法1、样品稀释液的制备准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡 20min,使微生物细胞分散，静置2030s，即成10 1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10 1稀释液1m L,移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸 3次，让菌液混合 均匀，即成10

7、"稀释液；再换一支无菌吸管，吸取102稀释液1mL,移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸 3次，即成103稀释液；以此类推，连续稀释，制成104、105、106、10 7、10 8> 10 9等一系列稀释菌液。用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用107、108、10 9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用104、105 > 10 6稀释度，测定放线菌数量时，采用103、104、105稀释度，测定真菌数量时，采用102、10 3> 104稀释度。2、平板接种培养平板接种培养有混

8、合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。混合平板培养法将无菌平板编上 107、10 8、10 9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌 操作要求吸取1X109稀释液各1mL放入编号10 9的3个平板中，同法吸取 10 8稀释液各 1mL放入编号1刈08的3个平板中，再吸取1X107稀释液各1mL放入编号1乂10一7的3个 平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却 至4550C的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30 C下培养。至菌落长出后即可计数。涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁

9、热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。 再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。 将涂抹好的平板平放于桌上 2030min,使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培 养，至菌落长出后即可计数。JI图示稀和平板测数法中样品的稀粒和棉降液的取样培养划线法（不采用，因为需要对乳酸菌和大肠杆菌进行筛选培养）:用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是

10、在平板的一边做第一次“Z字形划线。转动培养皿70。角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z'字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180。，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种 曲点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯 化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。以上各种分离法，都应按无菌操作进行。所用的培养基若在倒平板前，按50四/m L的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。3、培养（16个

11、小时即可）将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于2830C培养，至长出菌落为止（2436h）。4、挑菌纯化在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯， 应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。5、计数选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30300的平板，分别按 稀释平板测数法”中的 混合平板测数法”和 涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数， 若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数（烘干土的质量/原土样的质量）。（四）数据的收集整理：数据库模板的建立二大肠杆菌（一）大肠杆菌的基本属

12、性：（二）仪器和试剂：仪器：试剂：液态培养基： 配制每升培养基，应该在950 ml去离子水中加入：胰化蛋白月东10g, 酵母提取物 5g , NaCl 10g。摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离 子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌 20min。固态培养基：LB固体培养基 1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之 前加好抗生素，并且倒好板。LB固体培养基倒板1. 配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。2. 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB固体培养基置与 55 C的水浴中，待培养基 温度降到55C时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过

13、高导致抗生素失效，并充分摇匀。3. 倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15 分钟。4. 保存：用封口胶封边，并倒置放于4C保存，一个月内使用。（1）普通培养基：固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min,取出后再无菌状态下铺平板（2） 选择性培养基：将消毒好的固体培养基置室温下冷却50 C时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度 2-3mm,室温固化。（抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到 无菌瓶中，氨节青霉素终浓度50 l/ml浙制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下

14、放2-3天,或37C放半小时，然后4C保存备用。（3） LB培养基中所用抗生素终浓度：氨节青霉素-50 l/ml;氯霉素-20 l/ml;庆大霉素 -15 l/ml卡那霉素-30 l/ml春日霉素-1000 l/ml壮观霉素-100 l/ml链霉素-30 l/ml四 环素-12 l/ml。（三）培养检测方法：乳品中大肠杆菌检测国标 GB/T4789.38-2008的具体步骤及达标的标准：第一法大肠杆菌MPN计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、 固体和半固体样品：以无菌操作取259样品，置盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min1000r/ min均质1 min2

15、 min，制成l:10样品匀液，或 置盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min制成1:10的样品匀液。6.1.2、 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL置盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无 菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成 1:10的样品匀液。6.1.3、 样品匀液的 pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠 （NaOH）或 1mol/L 盐酸（HCI）调节。6.1.4、 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取 1:10样品匀液1mL ,沿管壁徐徐注 人盛有9 mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触

16、及稀释液面），振摇 试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成 1:100的样品匀液。6.1.5、 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列样品 匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕， 全过程不得超过 15 min。6.2、初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）。每个稀释度接种3管月桂基磺酸盐胰蛋白陈（LST ）肉汤，每管接种1 mL （如接种量超过1 mL ,则用双料LST肉汤）。36CMC培养24h±2h ,观察小倒管内是否有气泡产生，如未产气 则继续培养

17、至48h+2h。记录在24h48h内产气的LST肉汤管数。如所有 LST肉汤管均 未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，则进行复发酵试验。6.3、 复发酵试验用接种环分别从所有培养48h 2h内发酵产气的 LST肉汤管中取培养物1环，移种于已提前预温至45 C的EC肉汤管中，放人带盖的 44.5C戋C水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24h+2h ,检查小倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至 48h 2h。记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有 EC肉 汤管均未产气，即可报告大肠杆菌MPN结果；如有产气者，贝U进行EMB平板分离培养。6.4、伊红美蓝平板分

18、离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物划线分别接种于EMB平板，36 C 士 C培养18h24h。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。6.5、 营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5个典型菌落，如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36 C ±1 C ,培养18h24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。6.6、生化试验6.6.1、 靛基质试验：将培养物接种蛋白陈水，36 C 土 C培养24h 2h后，加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL0.3 mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。6.6.2、 MR -VP 试验：将培养物

19、接种 MR -VP 培养基，36 C 1 C 培养48h史h。 移取培养物1mL至13 mn 100mm试管中，加5 %佑蔡酚乙醇溶液 0.6mL、40 %氢氧化钾 溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为 VP试验阳性。将 MR 一 VP培养液的剩余部分再培养 48h后滴加5滴甲基红指示剂。培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。6.6.3、 柠檬酸盐利用试验：将培养物接种 Koser氏柠檬酸盐肉汤，36C ±1 C培 养96h±2h,记录有无细菌生长。6.7、 大肠杆菌MPN计数的报告大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸

20、、 广气，IMViC生化试验为+ + -或-+ -。只要有1个菌落鉴定为大肠杆菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据 LST肉汤阳性管数查 MPN表，报告每克（或毫升） 样品中大肠杆菌 MPN值。第二法大肠杆菌VRB - - MUG 平板计数法8、样品稀释按6.1进行。9、 检验选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度分别取1 mL注 人两个无菌平皿。 另取1 mL稀释液注人一个无菌平皿中，作空白对照。将 45 C也.5 C的 VRB琼脂10 mL15 mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。待琼脂凝固后，再加3 mL4mL VRB-MUG 琼脂覆盖

21、平板表层。凝固后翻转平板，36 CM C 培养18h24h。选择菌落数为 10100的平板，暗室中 360 nm366 nm 波 长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠杆菌ATCC 25922 ）和产气肠杆菌（如 ATCC 13048 ）做阳性和阴性对照。10、大肠杆菌平板计数的报告两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告 每克（或毫升）样品中大肠杆菌数，以 CFU/g （ CFU /mL ）表示。第三法大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法12、样品稀释按6.1进行。13、检验13.1、接种和培养选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种两张测试片。将测试片置于平坦实验台面，。揭开上层膜，用吸管吸取样品匀液1ml匀液垂直滴加在测试片的中央，将上层膜缓