基因功能研究常用方法（课堂PPT）

1、1 第九章第九章 基因功能研究常用方法基因功能研究常用方法 主讲教师：熊伟主讲教师：熊伟 大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室2 弄清基因的生物学功能,才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能研究技术包括：（1）DNA克隆技术克隆技术（2）转基因技术和核转移技术（动物克隆）转基因技术和核转移技术（动物克隆）（3）基因敲除技术）基因敲除技术（4）反义技术）反义技术（5）RNA干涉技术干涉技术3 第一节第一节 DNA克隆技术克隆技术4克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本

2、或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆5技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆 即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）6DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子，继而通过转化复制子，继而通过转化或转染宿

3、主细胞，筛选出含有目的基因的转化子或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。分子。 也称也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA 。 7生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基

4、因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。8（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶9重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶10（三）目的基因（三）目的基因 cDNA 基因组基因组DNA目的基因目的基因 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）11（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖

5、或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA12克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体称为表达载体。13载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制；能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具

6、有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。141. 1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 15噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基

7、因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列163. 粘性质粒粘性质粒(cosmid)17酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他18二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本

8、原理克隆基本过程克隆基本过程目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 19 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录20（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4

9、. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第（见第22章）章） 21（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建若将外源基因连接到复制子(基因载体)上,外源DNA就可以作为复制子的一部分在受体细胞内复制.在基因克隆中基因载体的选择与构建是一项技术性很强的工作,直接影响到基因克隆的成败.22（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接2

10、3受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌（从大肠杆菌（从大肠杆菌K-12改造）改造）限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态导入方式导入方式转化转化 转染转染 感染感染（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌24（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等25重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤

11、载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录26 第二节第二节 转基因技术与核转移技术转基因技术与核转移技术27转基因技术转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动

12、物子宫，使之发育成个体。宫，使之发育成个体。 转基因转基因被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物( (transgenic animal)目的基因的受体动物目的基因的受体动物一、转基因技术一、转基因技术282930 转基因动物是动物整体水平研究目的基因转基因动物是动物整体水平研究目的基因的生物技术，特点是的生物技术，特点是“分子及其细胞水平分子及其细胞水平的操作，组织及动物整体水平表达的操作，组织及动物整体水平表达”31 转基因动物构建过程转基因动物构建过程 转基因载体的构建 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干细胞 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小鼠子宫中 对转基因动物进行

13、鉴定32 转基因的技术方法转基因的技术方法 DNA显微注射法 克隆法 胚胎干细胞技术 逆转录病毒介导的基因转移 精子载体法等各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法33 转基因动物的鉴定转基因动物的鉴定 Southern杂交 确定外源基因的整合以及整合的拷贝数 RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达情况 实时PCR（荧光定量PCR）34 转基因技术的应用转基因技术的应用 （1）建立致病基因表达、调控的动物模型 （2）动植物新品种的培育 （3）各种基因工程产品的制备 （4）探讨生殖细胞的基因治疗方法35 36核转移技术核转移技术 即即动物整体克隆

14、技术动物整体克隆技术，将动物体细胞，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆使之发育成个体，即克隆( (clone)。这样的个体所携带的性状仅来自一个这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或母亲个体父亲或母亲个体, ,为无性繁殖为无性繁殖. .19961996年年, ,克隆羊克隆羊”多莉多莉”的产生成为当的产生成为当年分子生物学发展最重要的事件年分子生物学发展最重要的事件二、核转移技术二、核转移技术37 克隆羊克隆羊“3839基因剔除技术基因剔除技术也称也称基因靶向基因靶向( (gene targeting) )灭活，灭活，有

15、目的去除动物体内某种基因的技术。有目的去除动物体内某种基因的技术。第三节、基因剔除技术第三节、基因剔除技术40 基因剔除程序基因剔除程序 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使这一灭活的基因通过同源重组取代原有目的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过显微注射到小鼠囊胚. 细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除小鼠.41 基因转移和基因剔除技术在基因转移和基因剔除技术在医学中的应用医学中的应用建立动物疾病可遗传的模型建立动物疾病可遗传的模型, ,探讨疾病发生机探讨疾病发生机制制 单基因决定疾病模型单基因决定疾病模

16、型 进行基因剔除以模拟基因失活进行基因剔除以模拟基因失活. .单基因疾病模型单基因疾病模型: :地中海贫血地中海贫血, ,动脉硬化动脉硬化, ,老年痴呆等老年痴呆等 多基因决定疾病模型多基因决定疾病模型 多基因疾病模型多基因疾病模型: :肿瘤肿瘤, ,高血压高血压, ,糖尿病糖尿病42 第四节第四节 基因沉默技术基因沉默技术43基因沉默技术基因沉默技术 反义(antisen)技术 RNA干涉(RNA Interference,RNAi)44反义技术反义技术 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成双链;作用于非编码区;作用于启动子 反义D

17、NA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译,其稳定性好,有广泛药用价值 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人工合成的核酶能抑制特定基因的表达45RNA干涉干涉(RNAi) RNA干涉技术是利用体外合成的短双链RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的技术,是转录后基因失活的一种研究基因功能的有力工具 机制:46Dicer47siRNA48Initiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRP49Effector Step siRNA binding siRNA unwinding RISC activation5051

18、医学分子生物学课程作业根据自身专业和研究方向，以RNAi技术在XXX领域的研究进展为题目，写一篇小综述。写作要求：1. 按照一般发表文献的格式书写。2. 可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相关文献，不得抄袭！3. 字数：3000字左右。4. 不得抄袭！不得抄袭！52论文格式 题目 摘要（Abstract) 200字以内 正文前言正文问题与展望参考文献 10-15篇53 完成方式：手写稿或电子打印稿 完成日期：2012年12月15日前交到医学实验楼B-312或者下周上课课堂上交。54疾病相关基因的克隆与鉴定疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of

19、 Disease Relative Genes第第 五五 节节55克隆疾病相关基因的策略克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆（一）功能性克隆( (functional cloning) )（二）定位克隆（二）定位克隆(positional cloning)（三）非定位候选基因克隆策略（三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches)（四）定位候选基因克隆策略（四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )56定义定义 从对一种致病基因的功能的了从对一种致病基因的

20、功能的了解出发，克隆该致病基因。解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆（一）功能性克隆应用应用 生化机制已明确、基因表达产物生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。较易得到部分纯化的遗传性疾病。57克隆方式克隆方式 利用特异性抗体筛选表达型利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；文库； 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选探针，筛选cDNA文库。文库。58（二）定位克隆（二）定位克隆定义定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。小范围，最后克隆该基因。系统的定位克隆工作

21、系统的定位克隆工作 遗传学分析遗传学分析( (确定致病基因染色体定位确定致病基因染色体定位) )交换分析、连锁不平衡分析交换分析、连锁不平衡分析 分子生物学分析分子生物学分析染色体异常染色体异常( (缺失、易位等缺失、易位等) )分析、基因分析、基因文库的筛选与基因克隆文库的筛选与基因克隆59基因定位的基本方法 1.体细胞杂交法 p283 2.原位杂交和荧光原位杂交 3.连锁分析60体细胞杂交: 细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞(杂种细胞). 大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色体而人染色体逐渐丢失 仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精力于某一染色体上,就可找到某一基因座位61原位杂交和荧光原位杂交(FISH): 根据疾病基因所编码蛋白质的信息,将其mRNA反转录成cDNA,再以cDNA为探针从基因组DNA中钓取该蛋白质量的编码基因 如:用及珠蛋白基因的cDNA作探针,与各种不同的人/鼠杂种细胞进行原位杂交,找出cDNA探针与人染色体DNA的同源互补关系,从而将及珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上.62连