YONG基因工程的基本操作程序

1、1会计学YONG基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因表达载体的构建基因文库 基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因组文库与部分基因文库的关系1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍模板DNA9550引物1引物2DNA引物引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶72第1轮结束第2轮开始955072TaqTaqTaqTaq72第2轮结束 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_

2、复制_的核酸合成技术。 前提条件：_； 原料：_、_ 、 _、 _。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNAn 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的

3、结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因 用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 用_切断目 的基因，使其产生_ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体 核心质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:2.基因表达载体的目的（1）使目的基

4、因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法Ca2+处理感受态细胞目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程（一）转化： 三、将目的基因导入受体细胞受体细胞稳定表达（1）农杆菌转化法特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程:Ti质粒目

5、的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相

6、对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程: 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测： 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定

7、（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法: 抗原-抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示 分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAm

8、RNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交

9、，看是否有杂交带。检测是否转录出了mRNA，利用分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链