AKTA蛋白纯化系统操作

1、AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为 AKTA EXPLORERAKTA PILOTAKTA PURIFIER多种型号的设备。 以下以AKTA EXPLORE的例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。1、认识AKTAAKTA explorer是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（ Fig 1）。它们是：FIG 1、AKTA EXPLORER机? Pump-900为双通道高效梯度泵系列。 在AKTAexplorer 100,

2、流速范围0.01-100 ml/min , 压力高达10 Mpa （泵名为 P-901）。在 AKTA explore10，流速范围 0.001-10 ml/min ,压力高 达 25 Mpa （泵名为 P-903）。? Monitor UV-900,同时监控 190 700 nm范围内高达 3个波长的多波长紫外-可见 （UV-Vis）监测器。（针对部分 AKTA PURIFIE朗型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为 汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）? Monitor pH/C -900，在线电导和pH监测的组合监测器。AKTA expl

3、orerFig 2、AKTA EXPLORE硬件模式图AKTA EXPLORER统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。分离装置由UNICORN软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系 统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。2、一般操作2.1开机按位于底部平台前左侧的 ON/OFF按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪 器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标, 进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口 （

4、Fig 3）Fig & Unicorn的操作界面2.2准备工作溶液和样品所有的工作溶液和样品必须经过0.45的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙睛、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。2.3清洗及管道准备首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将 B泵的进液管道（B1）放入 高盐溶液中，在 system control窗口点击工具栏内的 manual, 选择 pumppump wash explorer,选中A1,B1管道为ON, execute。泵清洗将自动结束。 （Fig 4）Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作2.

5、4安装层析柱在 manual里选择 pumpflow rate，输入一定的低流速 （ Fig 5）, insert;选择 Alarm&mon alarm pressure，设置high alarm （输入填料或层析柱的耐受压力，以较低 者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到），insert, execute （Fig 6）<待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。Fig 5 AKTA Explorer的流速设定操作Fig 6 AKTA Explorer的限压设定操作2.5开始纯化：1）在柱子

6、平衡好之后（电导， pH的数值和变化趋势稳定）即开始上样了。此时应 将紫夕卜调零（Fig 7），选择 Alarm&mon autozero , exectue。Fig 7、AKTA Explorer的紫外调零操作2）具体上样方式：AKTA系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行 上样，包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等，这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击pause,将A1放入样品中，点击 countine ,待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。3） 洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manual里选择pumpgradient,按照

7、自己的工艺选择 targetB (100%)和 length (10CV (Fig 8)。Fig & AKTA Explorer的洗脱条件设定操作4)设定收集：选择 Frafractionation_900，输入每管收集体积，exectue (Fig 9)。结束固定体积收集选择Frafractionation_stop_900 , exectue (Fig 10)。Fig 9K AKTA Explorer的组分收集设定操作Fig 10、AKTA Explorer的组分收集停止设定操作5) 清洗泵及卸下层析柱：将A1和B1入口放入纯水中，启动 pump wash purifier功能冲洗

8、 A泵和B泵及整个 管路。然后再将A1和B1入口放入20%乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头 拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。6) 关闭电源：从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭AKTA主机电源，关闭电脑电源。3、程序设定操作在method editor窗口点击工具栏内的method wizard，弹出窗口界面如 Fig 11所示，可以分别在 main selection、column以及column positio

9、n三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击next按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Fig 12）,在此可以设定检测的波长，针对AKTAEXPLORE时以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定A泵和B泵的溶液进口，设定好之后，点击next，出现如Fig 13所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。Fig 11Fig 12Fig 13Fig 14完成之后，点击 next出现Fig 14的窗口，在此可以设定上样的条件，可选择的条件包 括上样的方式，如上样环上样以及样品泵上样，对上样的体积也要进行设定。如果利用系统泵上样

10、，在此无法进行设置，不过可以利用A泵和B泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。在上步设置完成之后，点击NEXT出现如Fig 15所示窗口，这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器，具体内容可能有些差异，这里显示的界面是在安 装了 Frac-950收集器之后所出现的界面，设置完成点击NEXT出现如Fig 16所示的窗口，设置目标组分收集的一些参数，点击NEXT,出现如Fig 17所示的窗口，针对具体的洗脱条件可以进行设置。当全部设置完成之后，点击finish，弹出Fig 18所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改，完成之后点击 里L按钮，完成程序存盘操作。至此完成

11、洗脱程序的设定工作，在应用自动洗脱程序时， 可在SYSTEM CONTROL口点击文件菜单栏中的 FILARun, 在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行，之后会依次弹出一些对话框， 主要是再次确认程序的设置条件， 并选择洗脱结果文件的保存位置， 全部设置完之后，洗脱将自 动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。KTTli tj-K Ml k- Li. ft lb« EWJ-iL FaIpiIElui【虹+3 ap|iLiii E2 CflFracTWtri "上i I - ?醇1 nFig 16Fig 15 iil L*vLh Lli -IV"I i

12、Uta* r4Btafl uR CbB<R £. fl-t* S tf>dl IlLap FjTgdV I kEOn-Hb ba«t mtL» 砒 an* q b cnHfetM4wJ.l.hraii-n alWsr UhIi* 白 CPJdx %<! *!Fig 18Fig 174、结果的浏览与简单处理在纯化完成后，Unicorn软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如果没有指定，那么结果文件会保存于一个文件名以manual N开头的文件中，N为系统依次生成的一个1-10之间的数字。对于结果的浏览应在 evaluation窗口（ Fig 19

13、）中进行，打开文件及对文件进行普通编 辑的菜单如Fig 20所示。r* 遥，ci# i-JJt+T昔理 吕吁圳据利艾字H”心图MM提、-，,，亲 <bicn ilQ9wLi-»<x£.LriMt k”.E (ifefli HnpwYOvivViilWi: ana1! Uvfct"PFFig 20纯化结果普通编辑菜单这里已经选择了一个纯化文件， 可以弹出如Fig 21所示的操作菜单， 轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择properties , 如改变曲线的颜色，设定横打开后，可以分别对结果进行编辑,选择或设器浏览

14、内容】口人H、Fig 21Hradri.1%： LCwvt Nioks; I加 E FYi：.|X Axii：XTI选歼曲戏PeakTabl#:设定飘分表内容Curve Style d colcrnr ：ll|-1.找形及领色Et Test潟雄tM牢Lavout Library:保有刻翼桥式4、AKTA蛋白纯化系统的日常维护4.1每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐浓度洗脱缓冲液为甚！假如，不能避免，则紧记次日尽早用 System Wash Method 完成以蒸储水将系统彻底清洗，再予以保存或再更新使用其它缓冲液，再次投入使用进行实验操作。用蒸£留水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此 举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久