siRNA转染方法

1、EngreenUp«rWe Yow Stu4y第 3 页 共 4 页Entranster-R（用于将siRNA转染入动物细胞）使用手册Size:0.5mlSize:lmlCat. No. 18668-06Cat No. 18668-07常温运输，储存于49一产品介绍英格恩生物公司（Engreen Biosystem Co,Ltd.）是专业的转染试剂研发生产厂商。 EntransteP1是英格恩生物公司研发合成的纳米聚合物转染试剂，该试剂采用纳米技 术合成，是最新一代非病毒转染试剂。由于纳米技术的应用，Entranster-R在细胞 转染过程中，表现了卓越的低毒、高效的性能。本品推荐用

2、于将siRNA转染入贴壁动物细胞（如哺乳动物细胞系、昆虫细胞系）本品在多种细胞系的验证中均表现了很好的siRNA转染效率，并有很低的细胞毒 性，而较低的细胞毒性对RNAi实验尤其重要。由于siRNA的设计、合成、工作浓度、 转染时细胞密度、以及转染试剂的量等均影响siRNA转染实验的效果，siRNA的转 染首先须优化条件。二条件优化实验（以24孔板为例）1 提前1天细胞种植根据表1推荐的细胞数量和培养基量，提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence ）在30-40%为宜，转染前全培养基总量为0.45ml> 表1提前1天种植细胞数董和培养基体积推荐培养容器转染

3、前1天接种细胞数量每孔表面积（C11?）每孔培养基总体积（ml）96 well7 500 土 2 500030.124 - well25 000 ± 10 0001.90.56 well/35 mm150 000 ± 50 0009.42.560 mmT25 flask400 000 士 100 000285100 minT75 flask1 000 000 土 250 0007&5102.S1RNA有效浓度和转染试剂量的优化siRNA浓度和转染试剂量的优化。根据表2,取4个EP管，每管加入相应数量 siRNA,然后加入一定量无血清稀释液体（建议采用OPTI-MEM

4、.无血清DMEM 或1640）,充分混匀，制成siRNA稀释液，终体积为25卩1。表2 siRNA浓度和转染试剂量的优化1234siRNA工作浓度25nM5011NI100nM150nM每孔siRNA的量(pmol)0.17pg(12.5pmol)033pg(25pmol)067gg (50pmol)Mg (75pmol)每孔转染试剂量0.5 卩 11卩12卩13卩1注意：对21nt双链siRNA oligo来说，平均分子量约为13300g/mol,合成siRNA 其OD值和rnnol换算关系由于OD值受产物中其他成分影响，具体请询问合成公 司、一般 1OD duplex Q 2.5-5 nm

5、ols = 33-66 ugo再取4个EP管，每管按表2相应加入Entranster-R,然后加入一定董无血清 稀释液体（建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640 ）,充分混匀，制成 Entranster-R稀释液，终体积为25卩1。室温帝置5分钟。（3）将Entranster11 R稀释液分别加入到对应siRNA稀释液中，加入后立即充分混匀 （可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温髓置30分钟（请保持足够 时间静置）。转染复合物制备完成。3转染将50卩1转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞 上，前后移动培养皿，混合均匀。注意：对本试剂，釆用

6、含血清的全培养基有助于提升转染效率。转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-72 小时在111RNA水平得到结果，继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。注意：在部分实验室，由于血清和培养条件等差异，转染后镜下培养基中可能出 现少量黑点状沉淀，为转染试剂和血清中蛋白结合产物，不影响转染结果和细胞 状态，可通过换液除去。表3不同细胞培养容器转染推荐用量细腕培养容器表面积 （cm2）表面积相对 于 24-well 比率每孔 siRNA 用量每孔siRNA 稀释液总体 积每孔Eutranster-R用量Entranster -R稀释液总 体积每孔培养 基总量96-wel

7、l0 3020 15咫10pl0.45pl10pl100卩148-well0 7040.3pg15pl09卩115 pl200卩 124-well1.910.67pg25pl2卩125pl500pl12-well3.821 33pg25pl4pl25pllinl6-well/35-mm1053.33pg50pl10pl50pl2.5ml60 nmi T25 flask2110667pg125gl20yl125 pl5ml100 imiVT75 flask583020.0pg250pl60pl250M15mlEngreenUpgrade Yo«r Study第 4 页 共 4 页注意：

8、由于siRNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了 siRNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。三优化条件的应用根据预实验确定的细胞密度、siRNA有效浓度和转染试剂量等优化条件，固定 siRNA(pg):转染试剂i?(|il)的比值，根据表3按培养器皿表面积比例应用到其他培养 容器。四其他亨项1. siRNA有效浓度和转染试剂量的优化，前面的优化方案是最简单的方案.为得到更 好的结果，优化方案每孔siRNA量可以从10nM-200nM优化，siRNA(pg):转染试 剂量(卩1)比值可以从1:2到1:8进行优化。2. 细胞密度.不同的细胞密度可能

9、会极大影响转染效率和细胞毒性，为求最佳转染 效果，建议转染时的细胞密度从20%到50%进行不同细胞梯度转染，确定最佳转 染数量。3. 步骤3(1)*的全培养基量.由于会影响siRNA在培养基中的浓度，建议采用推荐量.4. 稀释用液的选择，必须釆用无血清液体！建议釆用OPTIMEM、无血淸DMEM或 无血清1640。5培养时间.应用本转染试剂后，由于不同细胞和siRNA效率的差异，一般来说， 在mRNA水平观察RNAi效果的最佳时间是转染后24-48小时，在蛋白水平观察 RNAi效果的最佳时间是转染后4872小时。6.细胞生长的培养基。细胞生长的培养基没有特殊要求，可以采用含血清培养基或 加入抗

10、生素。五常见问题与解决方案问题可能原因解决方案转染后沉默 现象不明显siRNA与转染试剂比例不佳预实验优化细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%siRNA效率不高选择最优siRNA,并采用已知高效的siRNA做对 照RNA酶污染建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等 材料和实脸器具.转染后培养时间不够在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋 白水平可以到72小时后验证结果细胞毒性siRNA与转染试別比例不佳预实脸优化细胞密度不佳调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%培养基毒性采用含10 %-20%血清的全培养基细胞污染建议彻底溝洁所有细胞培养相关用品七储存与安全本品常温运输，储存于4°C,有效期12个月。本品使用安全，未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染，用清水冲洗即可。八其他相关试剂Entransterni-H:用于将 DNA 转染入 HEK293(T)、Hela、CHO 细胞。EntransterD:用于将DNA高效低毒转染入动物细胞。Entranster17'1-!vivo:用于动物体内转染。Enlight:高灵敏、低背景ECL发光试剂九质量保证北京英格恩生物科技有限公司对Entranster-R基因转染试剂的每批产品实行严 格质量检验，并进行