最新MS培养基的配制,灭菌等注意事项资料

1、精品文档、MS培养基母液母液成分规定量浓缩倍数称取量(mg母液体积(ml)配制1升 培养基 吸取量 定容编号种类1大量元素KN03190010190001000100NH4NO316501016500MgS04 7H2O370103700KH2PO41701017002CaCk 2H2O44010440010001003微量元素MnSO4 4H2O22.31002230100010ZnSO4- 7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4 7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.

2、54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.010010050010盐酸吡哆醇0.510025盐酸硫铵素0.11005烟酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1.大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCb 2H2O单独配制夕卜，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCb 2H2O配制同 上置于另一小口瓶中。2.

3、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO 7H2O和NQ-EDTA.2HO）作为一组单独配制外，其余化合物 可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在 1000ml容量瓶中， 置小口瓶中保存，贴上标签。3. 铁盐配制将 FeSO 7H2O和 Na-EDTA.2HO分别溶于450ml蒸馏水 中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调 PH至5.5加 水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。4. 有机物母液配制，按母液要求浓缩 50倍，除蔗糖按3%单独临时 称量外，其余分别称量后，溶解，定容在 500ml容量瓶中，置于小口 瓶中保存，贴上标

4、签。5. 母液最好在24C的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间 不宜过长， 无机盐母液最好在一个月内用完， 如发现有霉菌和沉淀产 生，就不能再使用。1. 制备母液和营养培养基时， 所用蒸馏水或无离子水必须符合标 准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯） 。2. 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 .生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样， 先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘 乙酸（NAA,吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA）, 2, 4-D等生长素和玉 米素（ZT

5、）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加 热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA可溶于少量1mol/L的盐酸中， 叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制 的母液每毫升则含有生长调节物质 0.5mg,配制后一般要求在低温（04C）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节 剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。二、培养基配制和灭菌一.养培养基配制程序（一）. 母液吸取量的计算配制培养基的升数公式 1 ：母液吸取量 =母液体积（CC x母液浓缩倍数培养基要求的含量公式 2：母液吸取量（各种生长调节剂）母液每CC的含

6、量（二） 各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2。； C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F.生长素萘乙酸（NAA：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量 95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至 1000ml； G. 细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT用少量1N HCL溶解 后, 加蒸馏水定容至 100ml。（ 三） 配制培养基（ 1000ml）1. 琼脂 : 称取 57g 琼脂，加入 300ml 蒸馏水，加热溶解直至完 全溶解为止 .2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂 的 300ml 蒸馏水中。3

7、. 各种母液的吸取（培养基 1L）（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCb 2H2O母液(B)各 100ml(2)分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素(C),铁盐(D)母液各 10ml( 3) 用 10ml 移液管或吸管吸取有机物( H) 10ml( 4) 移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中， 混合均匀后， 加热至 80C左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.86.0 , 过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。 二分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基， 1000ml 培养基 分装到 25-30 个三角瓶中，每个三角瓶约 30ml 左右(一般

8、占试管、 三角瓶容量 1/41/3 左右)注：培养基勿碰瓶壁。三. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可 进行灭菌。用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液 管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：1. 高压锅放水至平把架；2. 把包扎好的培养基装入高压锅 ;3. 盖上热压锅盖 , 上紧螺帽 ( 注意对角拧紧螺帽 ) 关上气阀和安全阀.4. 然后接通电源 .5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀，排除冷空气（此步很重要）。6. 排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，

9、具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源， 待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。7. 灭菌时间达到 20分钟后， 除去电源， 打开放气阀 （注意要逐渐放 气）待高压锅内的空气完全排除后， 打开热压灭菌锅盖 （注意对角扭松 螺帽）稍待冷后再把培养基取出。8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长， 应尽早使用， 但为了在使 用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于 25 C下保存4 天，如果培养基需要贮存较长时间，可在 4C低温下保存。灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规 格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。进水t放进培养基

10、t盖紧锅盖t关上放汽阀t检查安全阀t接上 加热源-待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀t0.11MPa（121C）下灭菌2025分钟，保持稳定压力t除热源t逐渐打 开放气阀t锅内空气排除完后t开放锅盖t稍冷后取出培养基。四、无菌操作技术（一） 植物材料表面消毒剂灭菌 从外界或室内选取的植物材料， 都不同程度地带有各种微生物。 这些 污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须 经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作手续接到培养基上， 这一过程 叫做接种。1. 接种步骤：第一步：清理材料流水冲洗加入吐温(或洗衣粉)清洗自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌 ：70%酒

11、精浸10-30秒无菌水 第三步：灭菌剂处理0.1-1%升汞5-8 min (或其他灭菌剂)第四步：无菌水进行冲洗注意事项：1 .灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存.2 .对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3- 4次，升汞一般5 -8次，每次不少于3 min3 . 灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底4 . 灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。5 . 灭菌液要充分浸没材料2. 无菌操作可按以下步骤进行：( 1)在接种 3 天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前 3 小时打开其内 紫外线灯进行杀菌；( 2)在接种前 20 分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；(

12、 3)接种员先洗净双手， 在缓冲间换好专用实验服， 并换穿拖鞋等；(4) 上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭精品文档工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一 遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽 等；材料吸干后，一手拿镊子、 一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的 切割。（如叶片切成 0.5cm2 的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎 尖要剥成只含 1-2 片叶原基） 在接种过程中要经常灼烧接种器械， 防 止交叉污染。（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌 30 分钟

13、，若 连续接种，每 5 天要大强度灭菌一次。常用植物激素类别名称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明2, 4二氯苯氧2, 4 D221.00.001 生长素IAA易被生乙酸10mg/L通常用植物细胞长a 萘乙酸NAA186.20.001 NaO H 溶所氧化。素10mg/L液滴至故培养基吲哚一3乙酸IAA175.20.001 溶解成中很少单10mg/L溶液。独使用。吲哚一3 丁酸IBA203.20.001 能溶于10mg/L乙醇6 苄基氨基嘌BA225.2分裂素玉米素不细呤通常能耐热，不胞6 糠基氨基嘌KT215.2溶于稀能高压火分呤NaOH 含菌。裂N异戊烯氨基ZT219.2水乙醇嘌呤或稀盐

14、（玉米素）酸赤霉素GA346.4能溶于不耐热不赤乙醇能高压火霉菌在愈伤素组织和悬浮培养物 的启动和 保持生长 时才需要 有时小植 株再生时 也需要四、常用药品的配置方法1.1mol/L HCI的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19 克/毫升，假设要配制1000ml 1moI/L HCI，则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取 37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml2. 1moI/L的NaOH的配制：称40gNaOH然后融于1000ml的蒸馏水中。（定容到100ml）3. 95%勺酒精配制成75%勺酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入 200ml的蒸馏水即可得到75%勺酒精。如果用无水酒精配制75%勺酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水250ml。4. 0.1%的升汞配