柑橘黄龙病检测鉴定技术规程--编制说明

1、柑橘黄龙病检测鉴定技术规程（草案）编制说明一、工作简况1. 任务来源为了保障江西柑橘产业的健康发展，维护好赣南脐橙的产量和品质，规范柑橘黄龙病检测鉴定技术，做好早期检测和预防，阻断病害的传播和扩散，促进赣南脐橙产业健康良好发展， 按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写有关规定，由国家脐橙工程技术研究中心提出并制订本标准。3、主要工作过程标准起草单位国家脐橙工程技术研究中心首先着手于国内外标准资料的搜集工作， 调研了现行柑橘黄龙病检测技术法律法规、规范和标准，全面了解和掌握了柑橘黄龙病发生特点、症状特征及检测鉴定要求。截止到 2016 年 10 月柑橘黄龙病

2、检测相关检测标准有国家标准 GB/T 28062-2011柑桔黄龙病菌实时荧光 PCR 检测方法和 GB/T29393-2012柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定两项，地方标准仅四川省地方标准 DB51/T 613-2006柑桔黄龙病检验鉴定技术规程一项。国家标准GB/T 28062-2011 是利用实时荧光PCR 检测方法进行检测，费用昂贵、检测条件要求高，无法大面积、大批量开展检测工作，不能在生产上进行推广和广泛应用， 标准 GB/T 29393-2012的 PCR检测方法中所用的引物和扩增体系在用于检测赣南地区柑橘黄龙病样品时，时常会出现目标条带外的非特异性扩增，干扰检测结果，影响鉴定结果。另

3、外，柑橘黄龙病病原菌存在遗传变异特性，不同区域的病原菌存在较大的差异， 四川省地方标准 DB51/T 613-2006 的检测技术针对我省柑橘黄龙病菌不能有效检测和鉴定， 利用此技术前期在国家脐橙工程技术研究中心实验室检测试验中常出现假阴性情况， 无法对疑似病害进行准确的鉴定。江西省是全国重要的柑橘产区， 目前赣南脐橙种植面积近 160 万亩，产业集群产值 100 多万元， 2016 年赣南脐橙品牌价值 668.11 亿元，居全国初级农产品类地理标志产品区域品牌价值榜榜首。 近年柑橘黄龙病对江西柑橘产业，特别是对赣南脐橙产业造成了严重的危害、仅赣南地区因黄龙病的危害砍除病树近 3000 万株，

4、带来了巨大的经济损失。赣南脐橙产业由于缺乏针对柑橘黄龙病有效的检测鉴定技术标准，导致果树在病害传染前期缺乏及时准确的诊断， 阻碍了生产上防控措施的实施， 延误了病情及提前阻断病害的传播， 为了保护我省柑橘产业的健康发展和赣南脐橙的产量和品质， 进一步提升赣南脐橙品牌价值，因此急需在我省建立柑橘黄龙病检测鉴定技术标准，在生产上做好早期检测和预防， 阻断病害的传播和扩散， 为我省柑橘产业的健康发展保驾护航。本规程的检测鉴定技术经国家脐橙工程技术研究中心拟定后，在江西柑橘产区多点采样、经实验室、江西柑橘产区果园反复验证，诊断效果可靠，已建立和完善了针对江西柑橘黄龙病的检测技术体系，目前已在赣南地方得

5、到广泛应用，并已在生产上对外开展服务，特别是受赣州市果业局委托， 赣南各苗圃出圃的幼苗均需国家脐橙中心实验室进行检测鉴定无病后方可进入果园种植，此技术的应用为保障赣南脐橙产业的健康发展做出了重要贡献，为该标准的制定提供了生产第一手资料，奠定的技术基础，参考国内柑橘病害检测技术，柑橘苗木产地检疫规程技术，综合草拟了标准草稿。4、起草单位与主要起草人本标准起草单位：国家脐橙工程技术研究中心。本标准主要起草人：易龙、黄爱军、苏华楠、卢占军、钟八莲。国家脐橙工程技术研究中心位于江西省赣州市经济开发区，于2013 年 4 月 2 日经科技部批准发文同意立项组建。现有专门从事脐橙科技研发、成果工程化、技术

6、示范推广的科技人员76 人，其中高级职称 44 人，博士 32 人，成果工程化人员15 人，研究生 52 人，兼职科研人员 12 人。实验室面积 6000 m2，仪器设备价值 3000 余万元，承担国家科技支撑计划、国家自然科学基金等国家级项目等课题 30 余项，申请国家专利 18 项；获国家科技进步二等奖，江西省科学技术一等奖等各类科研奖项 13 项，牵头制订了脐橙、赣南脐橙国家标准及地方标准 16 项。二、标准编制原则和主要内容本标准按照 GB/T1.1-2009标准化工作导则第一部分：标准的结构与编写规则的规定编写。本标准适用于芸香科植物感染柑橘黄龙病植株的PCR检测和鉴定。本标准主要内

7、容包括柑橘黄龙病检测鉴定术语和定义 ,根据柑橘黄龙病的田间症状调查及实验室 PCR 检测技术要求，规定了柑橘黄龙病的田间症状识别特征、室内检测仪器、试剂、样品预处理要求，样品 DNA 提取、 PCR 检测技术体系及检测鉴定方法等内容。三、标准的主要技术内容说明1、主要技术要求（ 1）田间实地取样参照 GB 5040.（ 2）样品要求：叶片：疑似症状植株样品取样，优先挑取疑似症状叶片。若未发现疑似叶片，即按照树冠东、南、西、北四个方向采集，每点取中下部叶片成熟叶片五片， 每棵树共采集叶片 20 张。种苗：取样时优先挑取疑似症状植株， 没有发现疑似症状时可按照抽检方规定抽检率随机抽取规定棵树植株，

8、 每株种苗抽取中下部成熟叶片 10 片。果实：幼果期采样时，每个植株按照东、南、西、北四个方向采集幼果，切取果柄、果蒂。商品鲜果取样时按每批次果实随机抽取 10 个果实，取果实中柱。（ 3）样品保存：采集的样品分别用样品袋进行分装，可放入适量的湿报纸进行样品的保湿， 做好每个样品的记录， 将样品记录和样品一并寄送实验室进行检测。 实验室对于接收样品进行登记编号， 存放于 4条件下，及时进行样品 DNA 核酸抽提。2.检验检测要求（1）样本 DNA 的抽提技术对于疑似症状的样品， 每份挑取 5 片叶片。每份样品切取叶片的叶柄及叶片基部主脉部分0.3 g 左右。疑似果实切取果实中柱部分0.3g 左

9、右。1）取 1.5 mL 离心管加入抽提液900 L ，蛋白酶 K 10 L ，放入水浴锅中， 55 65备用；2）将称取好样品，放入研钵中加入液氮充分研磨，直至成细粉，迅速转入水浴离心管中并用力摇匀，水浴3040 min，中间每隔 10min颠倒混匀2 次；3）12900 rpm 离心1 min，吸取上清液，加入等体积的Tris-酚：氯仿：异戊醇（ 25:24:1），轻柔颠倒混匀呈乳浊状，室温下静置至少10 min；4）12900 rpm 离心 3 min，吸取上清液，加入等体积的氯仿：异戊醇（ 24:1），轻柔颠倒混匀，静置至分层；5）12900 rpm 离心 2 min，吸取上清液，加

10、1/10 体积的醋酸钠溶液，再加入等体积的异丙醇溶液， 轻柔颠倒混匀，出现白色絮状沉淀，室温静置 10 min；6）2000 rpm 离心 20 s，去上清，加入75%乙醇溶液漂洗23次；7）最后一次漂洗时， 12000 rpm 离心 1 min，收集沉淀，放置金属浴上 55干燥沉淀至半透明状；8）加入 120200 L 1×TE 溶液，手指轻弹溶解沉淀，也可使用金属浴 55助溶，短暂离心 10 s 收集溶液，放入 -20贮存备用。（ 2）样品 DNA 的 PCR 扩增柑橘黄龙病的PCR 检测体系见表 1，体系总体积 25L。表1. 柑橘黄龙病 PCR 检测体系试剂（ Reagent

11、）每管加入量（ (Volume ， L）10×PCR Buffer4.510mol/L 上游引物0.410mol/L 下游引物0.410 mmol/L dNTPs0.35 U/ LTaqDNAr聚合酶0.3ddH2O18.1模板1.0合计25引物采用韧皮部杆菌亚洲种特异引物对：OI1/OI2c，引物序列为：OI1：GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA ，OI2c：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT 。PCR 反应程序： 95，预变性， 3 min，95，变性，30 s，64，退火，30 s，72，延伸，1 min 20 s，35 个循环， 72，延伸 7 min。

12、检测同时设阴性对照和阳性对照。（ 2）琼脂糖凝胶电泳取 57L PCR 扩增产物，加 3L 6× loading buffer，充分混合后，上样于 1.0%琼脂糖胶胶孔中， 100 V，电泳 30 min，经 EB 染色后，使用凝胶成像系统观察结果。四、标准技术内容的确定待检样品核酸经 PCR 扩增后，产物经电泳于凝胶成像系统观察，凝胶上阳性对照出现一条约 1160 bp的特异性条带，阴性对照没有任何扩增条带。待检样品若出现与阳性对照相同大小的 1160 bp特异性条带，则判定该样品为阳性，即携带柑橘黄龙病病原菌，若未出现任何扩增条带，则判定样品为阴性，即未携带柑橘黄龙病病菌。五、采

13、用国际标准和国外先进标准的程度， 以及与国际、 国外同类标准水平的对比情况。柑橘黄龙病检测鉴定技术没有国际标准、国外先进标准， 目前针对柑橘黄龙病的相关检测标准有国家标准GB/T 28062-2011柑桔黄龙病菌实时荧光PCR 检测方法和 GB/T 29393-2012柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定。国家标准 GB/T 28062-2011是利用实时荧光 PCR检测方法进行检测，费用昂贵、检测条件要求高，无法大面积、大批量开展检测工作，不能在生产上进行推广和广泛应用。标准GB/T29393-2012 的 PCR 检测方法中所用的引物和扩增体系在用于检测赣南地区柑橘黄龙病样品时，时常会出现目标条带外的非特异性扩增，干扰检测结果， 影响鉴定结果。 而本标准针对的是我省的柑橘黄龙病菌准确有效的检测和鉴定技术，样本 DNA