橡胶树种子的体外抗菌活性研究

1、    橡胶树种子的体外抗菌活性研究    石舒瑾崔丽丽王金梅【摘 要】目的：研究橡胶树种子对3种临床常见菌株的抗菌活性。方法：采用纸片扩散法测定橡胶树种子各部位浸膏的抑菌圈。结果：橡胶树种子乙酸乙酯部位和正丁醇部位对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超光谱-内酰胺酶金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均>6 mm。结论：橡胶树种子有一定的抗菌活性，且其乙酸乙酯部位和正丁醇部位在浓度为50 mg/ml抗菌活性相当，石油醚部位则没有抗菌活性。【关键词】橡胶树种子 抗菌活性 纸片扩散法橡胶树hevea brasiliensis （willd.ex a.

2、juss.） muell.arg.为大戟科橡胶树属植物，原产巴西，现广泛栽培于亚洲热带地区，我国台湾、福建等地均有栽培，以海南和云南种植较多，本种是最主要的天然橡胶植物1。橡胶树具有很高的经济价值，是制备天然橡胶的材料，广泛用于工业、国防、医药卫生等领域。橡胶树种子也有很高的应用价值，种仁含油量高达45%55%，主要成分有豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸等2。研究表明3-5，橡胶树种子能够降血脂，还能改善家兔主动脉动脉粥样硬化病变。然而对橡胶树的研究多集中在基因组学方面，药学方面的研究很少6-7。本试验采用纸片扩散法对橡胶树种子的抗菌活性进行了初步研究，以期丰富橡胶树的

3、研究开发。1 仪器和材料1.1 仪器jj-cj-2fd超洁净工作台（吴江市净化设备总厂）；grp-9720恒温隔水式培养箱（上海森信试验仪器有限公司）；zwy-211c恒温卧式培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；ldzx-30kb立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；zwx-201a紫外线空气消毒器（广东粤华医疗器械厂）；涡旋器；sz-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。1.2 试剂营养肉汤，营养琼脂（北京奥博星生物技术有限公司）；青霉素g（penicillin g.k-salt：c16h17n2o4sk），activity：156u/mg，25mg；硫酸链霉素（stre

4、ptomycin suifate research grade： c21h39n7o12 1.5h2so4），activity：759u/mg，10mg（购买于serva公司）；dmso，1，3-丙二醇，无水乙醇（均为分析纯）。1.3 供试菌株金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，sa），耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methcillin-resistant staphylococcus aureus，mrsa），产超光谱-内酰胺酶金黄色葡萄球菌（extended spectrum -lactamases staphylococcus aureus，esbls-sa），所有菌

5、株均为河南大学淮河医院临床分离菌株，经全自动微生物分析仪vitek-ams鉴定，符合率99%。1.4 药材橡胶树种子于2014年11月采集于海南省万宁市兴隆镇，由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为大戟科橡胶树（h. brasiliensis）的种子。标本现存于河南大学中药研究所。2 方法2.1 液体和固体培养基的配置营养肉汤培养基配制：称取营养肉汤干粉18g，用1000ml蒸馏水溶解，分装于锥形瓶中，于121，0.15mpa下灭菌15min，备用。营养琼脂培养基配制：分别称取琼脂干粉15 g和营养肉汤干粉18g，用1000ml蒸馏水加热溶解，分装于锥形瓶中，于121，0.15 mpa下灭菌15

6、min后，立刻将灭菌琼脂分装于无菌平皿中，备用。2.2 菌悬液的制备将临床分离鉴定后的sa、mrsa、esbls-sa进行菌株扩大培养，平板划线法接种在琼脂平皿中，37培养18 h，用接种环取出单个菌落2个，接种在100 ml灭菌肉汤中，于120 r/min、37恒温摇床培养至对数生长期，酶标仪测定吸光度值，用新鲜灭菌的肉汤将菌液稀释至吸光度值为0.1，稀释后菌液约为1×108 cfu/ml，现配现用。2.3 样品的制备取橡胶树种子650g，用70%乙醇浸渍提取3次，每次3天，合并提取液，浓缩得到浸膏（68g），将浸膏用水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，浓缩，分别得到石

7、油醚部位（8g）、乙酸乙酯部位（18g）、正丁醇部位（10g）。分别称取适量各部位浸膏加适量dmso溶解，配成50mg/ml溶液，备用。2.4 抑菌圈的测定采用纸片扩散法测定橡胶树种子的抗菌活性。按照文献8的方法，用微量加样器吸取5l样品加到直径为6mm滤纸片上，挥干溶剂后，等距贴于含菌平板上，用溶剂做空白对照，用硫酸链霉素和青霉素g做阳性对照（浓度为4 mg/ml），于37恒温培养箱内培养18h，记录抑菌圈直径。每份样品均平行操作3次，结果取平均值。所有操作均在无菌条件下进行。3 结果本文章采用纸片扩散法考察了橡胶树种子石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对三种金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果

8、采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用spss19.0软件单因素方差分析法（one-way anova）比较其显著性差异，具体结果见表1。4 讨论由表1可以看出，橡胶树种子乙酸乙酯部位和正丁醇部位在浓度为50 mg/ml对sa、mrsa、esbls-sa均有一定的抑制活性，与阳性对照青霉素g和硫酸链霉素相比，二者抗菌活性均弱于阳性对照，结果具有显著性差异（*p0.5，*p0.001）。橡胶树种子石油醚部位则没有显示抗菌活性，说明橡胶树种子的抗菌活性部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。 橡胶树的应用价值众所周知，早在90年代，就有人预测橡胶树可能成为未来的药物工厂，能用于生产胰岛素疫苗，抗血栓药物

9、等9。目前橡胶树的研究主要集中在基因组学、蛋白质组学等生物信息学的研究，取得了很大成就10-12。本文从药学的角度对橡胶树种子进行研究，丰富了橡胶树的研究内容。参考文献：1中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志m.北京：科学出版社，1982，31：202.2尹桂豪，曹建华，刘春华，李春丽，张世瑞.橡胶树种子油的超临界提取及成分分析j.安徽农业科学，2009，19：8814-8815.3刘超然，王明英，杨良，等.橡胶种子油医用的研究j.热带作物学报，1980，1（1）：89-97.4李运珊，刘玉仙，李世泰.精炼橡胶种子油降血脂的临床应用研究j.海南医学院学报，2006；6（2）：65-68.

10、5唐朝才，刘爱华，杨树，等.橡胶种子油食用价值的研究j.热带作物学报，1981，2（1）：91-100.6王靖，邓小敏，田维敏.巴西橡胶树乳管细胞hblmyc3互作蛋白筛选与功能分析j.热带作物学报，2016，06：1-7.7何海霞，张宇，王萌，杨叶，郑服丛.巴西橡胶树（hevea brasiliensis）hbmlo7基因克隆与表达分析j.植物生理学报，2016，06：917-925.8康文艺，刘瑜新，宋艳丽，张丽.尼泊尔酸模-葡萄糖苷酶抑制活性及抗菌活性研究j.中成药，2010，07：1249-1251.9吴贵洲. 橡胶树未来的药物工厂j.热带作物译丛，1992，06：21.10邓玉杰，余海洋，张宇，王萌.一个巴西橡胶树过氧化物酶基因克隆与生物信息学分析j.热带农业工程，2014，04：1-8.11朱晋恒，戚继艳，肖小虎，唐朝荣.巴西橡胶树葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的克隆和表达分析j.热带作物学报，2016，06：1-9.12康桂娟，黎瑜，曾日中.巴西橡胶树hbnam基因克隆和表达