中药材提取物功能研究

1、中药材提取物功能研究1材料1.1饲养动物选取体重在1822g的雄性小鼠，小鼠及鼠粮购于兰州大学医学校区。木 实验室饲养条件：饲养房温度控制在37°c,小鼠在专用鼠笼屮进行饲养，每天 更换水瓶，每天添加鼠粮，垫料每两天更换一次。12实验器材毛巾、鱼网、卫生纸、医疗胶布、铅皮、凹形针、塑料桶、小太阳、热得快、 小注射器、灌喂针、鼠笼、水瓶、计时器、锡纸、称量纸、滤纸、50ml冻存管 管、5ml冻存管、冰盒、标记笔、eppendorf管、酶标板、一次性试管、10ml玻璃 试管、试管架、棕色试剂瓶、量筒、移液器及枪头、密封瓶、保鲜膜、液氮罐。13实验仪器表i-i实验主婆仪器名称型号产地水迷宫

2、电子天平cp214中国上海恒温水浴锅b-260中国上海紫外分光光度计754n中国上海荧光酶标仪1.4实验溶液及试剂牛理盐水、4%多聚甲醛固定液、液氮、冰酩酸、浓硫酸。(1) 4%多聚甲醛固定液配制：nah2po4 2h2o2.964gna2hpo4 12h2o29.010 g多聚甲醛40gdh2o1000ml总量1l(2) a药配制：将a原液稀释一倍为i液a中浓度：取i液50ml,定容至200ml(按照需要剂量同比例缩小！下同);a高浓度：取ii液150ml,定容至200mlo(3) b药配制：将b原液稀释一倍为ii液b中浓度：取ii液60ml,定容至200ml；b高浓度：即ii液。注意：毎次

3、灌喂z前盂要摇匀；剂量:0.2毫升/10克体重1.5实验所需试剂盒总抗氧化能力(t-aoc)测试盒、丙二醛(mda)测试盒、超氧化物歧化嗨(sod)测 试盒、肝/肌糖原测试盒、活性氧(ros)检测试剂盒及bca蛋白定量试剂盒均购于南京建 成生物工程研究所。1.6实验经费表1-2实验经费表名称单价数量总价实验小鼠5.00140700.00鼠粮1袋毛巾2条卫生纸1袋医用胶布铅皮1.003条3.00塑料桶4个电暖气1台热得快2个生理盐水5.004瓶20.00锡纸50.001卷50.00液氮10.0010 l100.00酶标板(96孔)30.002板60.00一次性试管5包量筒冰醋酸(500ml)1瓶

4、浓硫酸(500ml)1瓶移液器(05000ml)保鲜膜3.001卷t-aoc测试盒150.002盒300.00mda测试盒250.002盒500.00sod测试盒500.002盒1000.00肝/肌糖丿京测试盒160.002盒320.00ros检测试剂盒680.002盒1360.00bca蛋白定量试剂盒2盒2方法2. 1小鼠体重进行称量先将购买的实验小鼠适应性喂养id,然后将小鼠随机分为6组：a药高浓度组、 a药中浓度组、b药高浓度组、b药中浓度组、正常对照组及训练对照组。每周 用电子天平对小鼠体重进行称量一次并纪录数据。并由称得的体重计算得出小鼠 的灌喂量。2.2中药材提取物灌喂小鼠木实验对

5、两种中药材提取物进行试验，分别编号a药和b药。中药材提取物 分为两种浓度：中剂量组药浓度为0.66g/ml,高剂量组药浓度为2. 00g/mlo a 药高浓度组、a药中浓度组、b药高浓度组、b药中浓度组分别灌喂相应药物。 正常对照组灌喂生理盐水。训练对照组不灌喂。每周灌喂6天，休息1天。小鼠 灌喂方法：右手抓住小鼠尾巴，让其前爪抓在鼠笼上，左手拇指及食指捏住小鼠 耳朵部位，屮指及无名指小心捏住小鼠后背，小指压其尾巴；右手拿注射器从小 鼠上频靠小鼠后背食管缓慢插入灌喂针后并缓慢注入药物或生理盐水。注：千万 要找准部位后再注入药物，很容易注入到气管屮；插入注射器一定要轻缓，很容 易伤到小鼠内部结构

6、。2.3小鼠负重游泳训练用塑料桶作为游泳池，力探 约35 cm,水温控制在34土2°c范阖内，每天换水， 每组各一个游泳箱；首先将小鼠进行适应性游泳2d,首次游泳20min, 1次/d； 在小鼠尾部距离尾巴2-3cm处粘上医用胶布并开孔，然后根据小鼠当时体垂用在 胶布上挂5%重量的回型针。每周游泳6天，休息1天。游泳结束后将胶布及回 型针取下，用毛巾和纸巾将小鼠身上的水擦干后放于电暖气下烘烤，待完全干后 放冋笼中正常饲养，每天游泳一次，游泳时间每周递增，依次为：5niin、8min. 12min> 15mino2.4小鼠力竭游泳待小鼠负重游泳训练4周后，进行力渴游泳。将小鼠放丁

7、水迷宫中，水深约 35 cm,水温控制在34土2°c范|韦|内。力竭判断标准为：以小鼠头部全部入水持 续8s不能游出水面为判定终点。力竭游泳按组进行，纪录各组力竭游泳时间。 2.5样本采集与处理2.5.1血液采集采用摘除眼球采血方法进行血液采集。方法如下：(1) 小鼠力竭游泳后，摘除小鼠眼球采血。每只小鼠可取1. 52. oml血液;(2) . 3500rpm 离心 15min;(3) .取上清4°c保存；预留一部分送医院作血常规检测。2.5.2取脑血液采集后小心用钱了抛离颅骨斤，取出脑肩用锡纸包裹后放于5ml冻存管 中并作好标记；每组预留3只小鼠的脑进行固定备用。2.5.

8、3脾脏、肝脏和股四头肌采集肝脏和股四头肌采集按此步骤进行：(1) .将生理盐水预冷；(2) .取出肝脏、脾脏及股四头肌后放入生理盐水中漂洗干净，去血液；(3) .用滤纸吸干水分后，在电了天平上称重并纪录数据；(4) .用锡纸包裹后低温冷冻保存。2.6 ros、mda、sod、t-aoc、肝糖原及肌糖原含量测定ros、mda、sod、t-aoc.肝糖原及肌糖原含量测定按照试剂盒说明书进行。2. 7血液生化指标将血清送往医院进行测定。2.8小鼠抗缺氧能力测定小鼠分为三组：a高浓度组、b高浓度组及对照组。灌喂5周后将小鼠分 组放入密封瓶中，并用保鲜膜进行密封。记录死亡时间。3. 结果3. 1小鼠体重

9、称量每周用电子天平对小鼠体重进行称量一次，结果如表31：表3 1小鼠体巫原始数据时期分组体重(g)平均第1周a高16.423.017.813.017.6a中20.518.819.720.219.8b奇16.421.215.714.717.0b中18515.013.613.515.2c17.717.117.113.916.5d13.817.716.916.516.2第2周a离18.922.919.528.432.625.524.025.421.025.124.128.324.6a32.929.328.728.526.718.513.818.830.520.920.520.324.1b离16.01

10、7.018.016.129.625.929.225.328.331.933.120.224.2b 卩24.720.719.920.119.016.828.626.129.025.923.1c28.924.426.613.316.421.515.424.017.931.122.0d22.022.121.629.530.528.525.125.527.823.724.524.325.4笫3周a高24.225.824.133.324.625.828.227.529.027.827.227.0a30.733.328.127.531.623.917.422.826.525.326.7b离26.829.7

11、29.926.333.129.536.120.623.021.727.7b28.229.624.926.426.722.925.125.222.125.7c31.926.923.926.730.221.323.624.319.925.4d26.223.624.824.722.024.231.028.128.030.629.126.6笫4周a髙31.428.930.330.737.631.530.429.032.129.531.131.431.2a31.828.034.230.834.928.038.835.731.532.6b高35.437.031.929.832.332.829.428.82

12、8.027.331.3b31.130.927.526.428.331.231.130.228.729.5c31.432.929.234.429.428.524.630.126.429.7d30.227.732.932.536.335.132.333.934.634.032.132.9笫5周a髙33.132.533.432.130.029.631.933.432.531.432.330.631.9a30.234.135.832.430.136.131.236.833.333.3b高31.631.232.334.134.336.631.328.233.428.330.432.432.0b39.23

13、2.930.430.128.732.3c27.232.530.127.833.432.831.433.131.0d28.034.831.534.034.536.232.735.936.635.933.634.0图3-1为利用graphpad prism数据分析图:图3-1小鼠笫1周至第5周体重分析effect of a and b drugs on mice weight in 1st weekeffect of a and b drugs on m ice weight in 2nd weekoroupteffect of a and b drugs on m ice weight in 3

14、rd week40reffect of a and b drugs on mice weight in 4th weekcompored with controieffect of a and b drugs on mice weight in 5th week3020groups3.2小鼠负重游泳至力竭时间待小鼠负垂游泳训练4周后，进行力竭游泳齐组时间统计如表3-2：表3-2小鼠力竭游泳时间力竭游泳时间纪录（小数点前表示分钟，小数点后表示秒）分组时间总数a高31.0545.3446.4963.2773.49116.10121.03124.38144.05163.42153.57167.341

15、04.1312只a 118.2024.1928.2431.3733.5744.0045.1548 3065.3237.599只b髙25.3525.3526.2741.2743.4051.5854.5371.5842.428只b 卩27.3036.4140.0044.3048.3948.5988.1091.4092.23107.4362.4210 hc10.0013.4014.0014.1226.1226.5834.2069.5279.5431.949只d11.1414.2324.0030.3733.4633.4834.2146.4450.5059.2283.1438.2011只图3-2为利用g

16、raphpad prism数据分析图:effect of a and b drugs on es time200-150-compared with control #compared with ah100-*groups3.3 ros、mda、sod、t-aoc、肝糖原及肌糖原含量测定ros、mda、sod、t-aoc、肝糖原及肌糖原含屋测定原始数据见附表；图3-3 为利用graphpad prism数据分析图：effect of a and b drugs on ros80rgroups34020宜i)soaeffect of a and b drugs on mdaeffect of a

17、 and b drugs on rlgceffect of a and b drugs on sodeffect of a and b drugs on t-aocfeffect of a and b drugs on muscle glycogen20ri»1 : : groups图3-3 ros、mda、sod、t-aoc、肝糖原及肌糖原含量a:超氧化物歧化酶(sod)分析b:丙二醛(hda)分析c:肌糖原分析d:总抗氧化能力(t-a0c)分析 e:肝糖原分析f：活性氧(ros)分析3.4小鼠抗缺氧时间农3-3小鼠抗缺氧时间分组小鼠抗缺氧时间(s)平均(s)实验组a高14. 27

18、14. 3915. 3415.4816. 0216.325. 4216. 75实验组b高14. 4915.319. 1719. 3621.5117. 97对照组12. 0213. 0313. 4414. 0415. 3613.584.讨论本实验室人员均是初次做该实验。所得到的数据未能达到预期效果。卜面对本次 实验失败的原因进行讨论以及为后续实验的一些建议：(1) 实验失败原因之一就是实验样本量太小，在适应性游泳过程屮，原预定小鼠游泳20min时间过长，造成样本量减少；（2）其次就是小鼠灌喂，刚开始灌喂方法不对，很可能将药物灌至小鼠气管屮 造成小鼠死亡，也有可能将灌喂针伸得太深导致小鼠内脏破裂后小鼠受你 对实验结果造成影响。日前灌喂手法已经熟练掌握；（3）力竭游泳时水温并没有严格控制在34±2°c范围内，每组游泳仅靠感觉水 温，很可能造成每组游泳温度不同造成力竭游泳时间差界，而这种差界并 非由药物作用造成。建议对水温进行严格控制，毕竞水温对小鼠运动及体 能机能彫响不小；（4）每组游泳完后应该对水迷宫清洗，更换温水后进行下一组鼠力竭游泳时间 测量。上一组游泳后的水里含有的物质（如小鼠的粪便、小鼠掉的毛、无 意中沾的垫料等）会对小鼠游泳造成影响。建议每组游泳完后应该对水迷 宫清洗，更换温水;（5）