β-内酰胺酶在肝细胞肝癌中的表达及临床意义

1、B-内酰胺酶在肝细胞肝癌中的表达及临床意义背景肝细胞肝癌 (Hepatocellular Carcinoma,HCC) 简称为肝癌 , 是消化系统 最为常见的原发性恶性肿瘤。相关调查显示 , 每年约有 100 万新发的肝细胞肝癌 的病例被检测出来 ,其中, 超过三分之二的新病例分布在西太平洋地区 1 。肝细胞肝癌的死亡率居全球第二位 ,最新研究数据显示 , 在全世界由恶性肿 瘤造成的死亡事件中,肝细胞肝癌所占的比例最高2。HCC具有起病隐匿、高度 恶性和快速进展的特征，且HCC患者的早期诊断仍是一个尚未被攻克的巨大挑战。大多数患者在肿瘤已发展为晚期时才得到明确诊断，而HCC勺常用治疗方案 如外

2、科切除、 肝移植、射频消融等手术治疗的禁忌症较多 , 因此, 通过上述手术疗 法来达到根治肝癌的目标的几率很低3,4。有研究显示HCC治疗后的1年总体 生存率较为良好 ,为 66.1%,而 3年、 5年总体生存率则分别降至 39.7%和 32.5%; 在早期HCC患者中分别为93.5%、70.1%和59.1%5。但由于缺乏灵敏的早期诊断方法,HCC的病死率依然很高。鉴于目前 HCC台 疗方法尚未被攻克的局限性，确定HCC发生的分子机制并开发新的早期诊断和预 后预测策略至关重要。越来越多的证据表明，代谢失调尤其是异常脂质代谢在包括 HCC在内的肿瘤 进展中发挥着巨大作用6-9。B -内酰胺酶(b

3、eta-lactamase,LACTB)主要位于哺 乳动物有核细胞的线粒体内 , 在人体的不同组织中普遍存在 ,特别是在骨骼、心脏、 肌肉和肝脏。作为哺乳动物活性位点丝氨酸蛋白丄ACTB与细菌青霉素结合蛋白在进化上 相关。LACTE可作为线粒体内膜组织和能量稳态的调节因子参与脂质代谢的调节 ， 继而抑制肿瘤进展 , 同时作为细胞代谢过程的新型蛋白酶同源物起作用 10此外,研究表明LACTB在一些恶性肿瘤如乳腺癌11、胶质瘤12、胃癌13 和结直肠癌14,15中的表达低于癌旁组织,过表达LACTB可以抑制肿瘤细胞的 增殖。以上研究表明LACTB可作为一种新型的表观遗传沉默肿瘤抑制因子，在肿 瘤的

4、进展中发挥着重要作用。然而丄ACTB在HCC中的表达情况和功能作用在很大程度上仍未被探索。目 的1.探究LACTB在肝细胞肝癌中表达水平的具体情况：分析TCGA数据库中 LACTB mRN在肝癌及癌旁组织中的转录水平是否有差异，以及LACTB mRN转录 水平与肝癌患者TNM分期、病理学分级和整体生存率(Overall survival rate,OSR)的相关性；探究LACTB在郑州大学队列的肝癌及癌旁组织中的表达 水平是否有差异，以及LACTB表达水平与肝癌患者TNM分期、病理学分级和整体 生存率的相关性;2.探究过表达LACTB寸肝癌细胞的表型的影响：体外过表达 LACTB寸肝癌细胞的增

5、殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响；体内实验验证过表达LACTB寸裸鼠成瘤能力的影响。方法:1.下载TCGA(the cancer genome atlas) 数据库中肝癌患者的临床信 息以及LACTB mRN转录水平相关数据进行筛选和整合，分别分析LACTB mRN在 肝癌及配对的癌旁组织中的转录水平，及LACTB mRN转录水平与肝癌患者TNM 分期、病理学分级和总生存率的相关性。 2. 选取 341 例肝细胞肝癌患者的组织标 本,这些患者于 2011年至2015年就诊于郑州大学第一附属医院 ,且经过病理诊断 确诊为肝癌。利用这些标本构建组织微阵列 (Tissue microarray,TM

6、A) 备用。 3. 采取免疫 组织化学(Immunohistochemical,IHC)染色法检测临床组织样本中 LACTE蛋白质 表达水平,并分析肝癌组织中LACTB表达水平与患者的临床病理特征的相关性及其对肝癌预后的影响4.利用慢病毒转染技术过表达LACTB并经蛋白印迹方法确认后,采取CCK-8 实验、EdU染色实验和克隆形成实验检测肝癌细胞的增殖能力，采取细胞划痕实 验和Tran swell实验检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力。5.采用表达LACTB的肝癌 细胞注射到裸鼠皮下 , 利用活体成像仪记录皮下肿瘤的生长速度 ,6 周后处死小 鼠取出肿瘤,并利用IHC方法检测LACTB及 Ki-67

7、的表达情况。6.采用GraphPadPrism软件(7.0版)和SPSS软牛(版本23.0)分析统计数据。 采用卡方检验来检测LACTB表达水平与肝癌患者临床病理学特征的相关性,采用 t检验用于比较组间差异；采用Kaplan-Meier生存分析探究不同的LACTB表达水 平对肝癌预后的影响。结果:1.TCGA分析结果显示,LACTB mRN碓肝癌组织中的表达水平比正常组 织明显降低;LACTB的表达水平在具有高病理学分级的患者中显著低表达 ，而在 不同TNM分期的患者中LACTB勺表达水平则未表现出明显的差异。2.Kaplan-Meier分析显示LACTB氐表达的肝癌患者总体存活率(Overa

8、ll survival,OS)和无复发生存率(Relapse-free survival,RFS)显著低于 LACTB高表达的患者。GSEA分析结果显示,与肝癌患者生存负相关的基因显著富集于 LACTB低表达 组，相反,与肝癌存活正相关的基因显著富集于 LACTB高表达组。3.免疫组化染色 结果显示肝癌组织中LACTB蛋白表达水平显著低于配对的癌旁组织;LACTB表达 在TNM分期1-11和III-IV 之间存在显著差异，并且在高TNM分级的组织中表达 更低。4.LACTB低表达的肝癌患者总体存活率(OS)显著低于LACTB高表达的患者 由单、多因素分析可知，低表达LACTE和高级别TNM分期是肝癌患者独立预后危 险因素。5.体外细胞实验的结果显示,过表达LACT列以显著抑制肝癌细胞在体外的 增殖、迁移及侵袭能力。6.体内实验结果显示,过表达LACTB寸于肝癌细胞在体