化学发光免疫技术PPT课件

1、第二十一章化学发光免疫技术 第1页/共42页1.1.化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。2.2.化学发光免疫分析的基本原理及其技术类化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型。型。3.3.化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技术。术。4.4.电化学发光免疫分析基本原理。电化学发光免疫分析基本原理。5.5.化学发光免疫技术的临床应用。化学发光免疫技术的临床应用。本章要点第2页/共42页目录 发光基本知识1化学发光免疫分析2化学发光酶免疫分析3电化学发光免疫分析4化学发光免疫技术的临床应用5第3页/共42页 化学发光免疫技术是将具有

2、高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的抗原抗体反应技术相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、维生素和药物等的检测分析技术。该技术具有特异性高、灵敏度高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学检验中应用广泛。 前 言第4页/共42页放射免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术金免疫技术化学发光免疫技术标记免疫技术第5页/共42页第一节 基本知识 一、发光发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态，释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发光。第6页/共42页1.1.光照发光

3、（光照发光（photoluminescencephotoluminescence） 发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。长的可见光。第7页/共42页2.2.生物发光（生物发光（bioluminescencebioluminescence） 发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用利用ATPATP产能，生成激发态氧化型荧光素，它在产能，生成激发

4、态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。第8页/共42页3.3.化学发光化学发光 某些物质某些物质( (发光剂发光剂) )在化学反应时，吸收了反应在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。出能量，这一现象称为化学发光。 第9页/共42页 一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足一个化

5、学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：以下条件：该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子 第10页/共42页 在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂化学发光剂或或发光底物发光底物。二.化学发光剂第11页/共42页 作为化学发光

6、免疫技术的化学发光剂应符合以作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条件：下几个条件： 发光的量子产率高 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 第12页/共42页 常用的化学发光剂或发光底物有常用的化学发光剂或发光底物有 1.1.直接化学发光剂直接化学发光剂 2.2.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 3.3.电化学发光剂电化学发光剂 第13页/共42页1.1.直接化学发光剂直接化学发光剂 在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，在发光免疫分析过程中不需酶的催化

7、作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。如常用的吖啶酯（抗体。如常用的吖啶酯（acridiniumacridinium，AEAE） 。第14页/共42页吖啶酯吖啶酯在碱性条件下被在碱性条件下被H H2 2O O2 2氧化时氧化时, ,发出波长发出波长为为470nm470nm的光，具有很高的发光效率，其激发的光，具有很高的发光效率，其激发态产物态产物N-N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。 第15页/共42页2.2.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 是利用

8、标记酶的催化作用，使发光剂（底物）是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。发光。 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧氧 化物酶（化物酶（HRPHRP）和碱性磷酸酶（）和碱性磷酸酶（ALPALP）。）。HRPHRP的常的常用用 的发光底物为鲁米诺或其衍生物，的发光底物为鲁米诺或其衍生物，ALPALP的发光底的发光底物物 为金刚烷（为金刚烷（AMPPDAMPPD） 第16页/共42页（1 1）鲁米诺或其衍生物）鲁米诺或其衍生物 鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化化学发光反应，辐射出最大发射波长

9、为学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm425nm的光。的光。 第17页/共42页 鲁米诺增强发光反应原理鲁米诺增强发光反应原理第18页/共42页（2 2）AMPPDAMPPD 3-(23-(2- -螺旋金刚烷螺旋金刚烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“- -磷酰磷酰氧基氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧杂环丁烷二氧杂环丁烷第19页/共42页3 3电化学发光剂电化学发光剂 电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌反应而发光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+和

10、电子供体三丙胺（和电子供体三丙胺（TPATPA）在阳）在阳性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反性电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。应。 第20页/共42页 用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体( (抗抗原原) )，与待测标本中相应的抗原，与待测标本中相应的抗原( (抗体抗体) )和磁颗和磁颗粒性的抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁粒性的抗体（抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物场把结合状态和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，这时只需加入氧化剂（分离开来，这时只需加入氧化剂（H H2 2O O2 2）和）和NaOH

11、NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，可从标收、记录单位时间内所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原准曲线上计算出待测抗原( (抗体抗体) )的含量的含量 第二节 化学发光免疫分析一、 检测原理第21页/共42页化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 第22页/共42页1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或与标本中

12、相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后抗原通过一定模式的免疫学反应后, ,最终通过在磁最终通过在磁场场中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物物进行分离的技术。进行分离的技术。 二、方法类型 第23页/共42页2.2.常用的免疫学反应模式常用的免疫学反应模式 双抗原夹心法固相抗原竞争法双抗体夹心法第24页/共42页三、技术要点抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离 (磁颗粒分离技术)化学发光反应 第25页/共42页 化学发光酶免疫分析（化学发光酶免疫分析（CLEIACLEIA）是用参与催化某）是用参与催化某一化学发光反

13、应的酶如辣根过氧化物酶（一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRPHRP）或碱性磷酸酶或碱性磷酸酶(ALP)(ALP)来标记抗原或抗体，在与待来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗体测标本中相应的抗体( (抗原抗原) )发生免疫反应后，发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后，加入经洗涤将结合物与游离的酶标物分离后，加入底物底物( (发光剂发光剂) )，酶催化和分解底物发光，由光，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算

14、出测定物的浓度。数据处理系统，计算出测定物的浓度。第三节 化学发光酶免疫分析一、 检测原理第26页/共42页碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图 第27页/共42页 1.1.根据标记酶不同分类根据标记酶不同分类 可分为辣根过氧化物酶标记的化学可分为辣根过氧化物酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析。发光酶免疫分析和碱性磷酸酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以前者常以鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常以AMPPDAMPPD作作为发光底物。为发光底物。 2. 2. 根据免疫学反应模式分类根据免疫学反应模式分类 同化学发光

15、免疫分析，主要同化学发光免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而不是直接标记发光剂。记发光剂。 二、方法类型 第28页/共42页三、技术要点抗原抗体结合反应 结合物与游离物的分离 （磁颗粒分离法 、微粒子捕获法 、包被聚苯乙烯反应珠或孔分离法 ）酶促发光反应 第29页/共42页 电化学发光免疫分析（电化学发光免疫分析（ECLIAECLIA）是以电化学发光）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体剂三联吡啶钌标记抗体( (抗原抗原)

16、 )，通过抗原抗体，通过抗原抗体反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定量分析，它包括电化学和化学发光两个过程。分析，它包括电化学和化学发光两个过程。 第四节 电化学发光免疫分析一、 检测原理第30页/共42页电化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图 第31页/共42页电化学发光免疫测定示意图第32页/共42页1.1.分离方法分离方法 常用磁颗粒分离技术常用磁颗粒分离技术2.2.免疫学反应模式免疫学反应模式 其反应模式同发光免疫分析，主要有双抗体其反应模式同发光免疫分析，主要有

17、双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种主要模式，所不同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。同只是相应抗原或抗体上标记的是三联吡啶钌。 二、方法类型 第33页/共42页三、技术要点抗原抗体反应 结合物与游离物的分离(磁颗粒分离技术)电化学发光过程 第34页/共42页第五节 化学发光免疫技术的临床应用一、化学发光免疫技术的特点1.1.敏感度高，甚至超过敏感度高，甚至超过RIARIA；2.2.精密度和准确性均可与精密度和准确性均可与RIARIA相比；相比；3.3.试剂稳定，无毒害；试剂稳定，无毒害；4.4.测定耗时短；测定耗时短；5.

18、5.测定项目多；测定项目多；6.6.已发展成自动化测定系统。已发展成自动化测定系统。 第35页/共42页1.1.甲状腺激素甲状腺激素 T3T3、T4T4、hTSHhTSH、FT4FT4、FT3FT3、抗、抗TPOTPO、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。、甲状腺球蛋白、抗甲状腺球蛋白抗体等。2.2.生殖激素生殖激素 -HCG-HCG、催乳素、促卵泡激素、促、催乳素、促卵泡激素、促黄黄体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋体激素、孕酮、雌二醇、非结合雌三醇、甲胎蛋白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。白、睾丸酮、硫酸脱氢异雄酮。3.3.肾上腺肾上腺/ /垂体激素垂体激素 皮质醇、尿皮质醇、人生长皮质

19、醇、尿皮质醇、人生长激激素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。素、甲状旁腺素、促肾上腺皮质激素。二、 化学发光免疫技术常见的检测项目第36页/共42页4.4.贫血因子贫血因子 维生素维生素B12B12、叶酸、红细胞叶酸、叶酸、红细胞叶酸、铁蛋铁蛋白等。白等。5.5.肿瘤标记物肿瘤标记物 AFPAFP、CEACEA、PSAPSA、游离、游离PSAPSA、CAl9-9CAl9-9、CAl25CAl25、CAl5-3CAl5-3等。等。6 6感染性疾病感染性疾病 衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原衣原体抗原确认、弓形体体抗原确认、弓形体IgGIgG抗体、弓形体抗体、弓形体IgMIgM抗体、抗体、风风疹病毒疹病毒IgGIgG抗体、风疹病毒抗体、风疹病毒IgMIgM抗体、巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒IgGIgG抗体、巨细胞病毒抗体、巨细胞病毒IgMIgM抗体等。抗体等。二、 化学发光免疫技术常见的检测项目第37页/共42页7 7糖尿病糖尿病 胰岛素、胰岛素、C C肽等。肽等。8 8心血管系统心血管系统