链霉素诱变育种的方案

1、11 11级生物技术班级生物技术班第二组第二组插曲(很有必要) 所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液，将并且是均匀状态的单细胞悬液，将121121灭菌灭菌的无菌水加入到培养有链霉菌斜面的试管中，的无菌水加入到培养有链霉菌斜面的试管中，用接种环轻轻刮下孢子，用接种环轻轻刮下孢子，( (所处理的细胞必须是处于对所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液），将含有孢子的无菌水转入三角瓶中，加入玻璃珠，液），将含有孢子的无菌水转入三角瓶中

2、，加入玻璃珠，在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在在摇床上打碎，经滤膜过滤后即得到单孢子率在9898以以上的单孢子悬液。上的单孢子悬液。目的：在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA的结构变异频率大幅度提高。 对诱变剂的敏感性高；对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力；具有特定生产性状的能力或潜力； 可采用划线分离法和稀释分离法进行纯化；可采用划线分离法和稀释分离法进行纯化； 该菌株变异幅度广；该菌株变异幅度广； 该菌株稳定性较好该菌株稳定性较好。 选择物理诱变剂中非电离辐射即选择物理诱变剂中非电离辐射即紫外线紫外线。 因为紫外线是一种使用时间长、效果好、因为紫外线是

3、一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂，大约有设备简单、值得推广的诱变剂，大约有80%80%的高产抗的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。 紫外线的诱变育种紫外线的诱变育种 紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，形成紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合，形成嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。嘧啶二聚体，碱基不能正常配对。 紫外线诱变一般采用紫外线诱变一般采用15W15W紫外线杀菌灯，紫外线杀菌灯，波长为波长为253.7nm253.7nm，灯与处理物的距离为，灯与处理物的距离为151530cm30cm，照射时间依菌种而异，一般，照射时间依

4、菌种而异，一般为几秒至几十分钟。为几秒至几十分钟。 在诱变育种中有两条重要的实验曲线在诱变育种中有两条重要的实验曲线: : 剂量剂量- -存活率曲线存活率曲线 剂量剂量- -诱变率曲线诱变率曲线 通过比较以上两曲线，可找到剂量通过比较以上两曲线，可找到剂量- -存活率存活率- -诱变诱变率三者的最佳结合点。在实际工作中，突变率往往随剂率三者的最佳结合点。在实际工作中，突变率往往随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量反而量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量反而会使突变率降低。根据会使突变率降低。根据UVUV、X X射线和乙烯亚胺射线和乙烯亚胺等诱变效应研究结果，发现正变较多地出

5、等诱变效应研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变较多地出现在现在偏低的剂量中，而负变较多地出现在偏高的剂量中。因此，在诱变工作中，大偏高的剂量中。因此，在诱变工作中，大多倾向于采用较低剂量（致死率在多倾向于采用较低剂量（致死率在70-70-80%80%）。）。 1 1将细菌培养液以将细菌培养液以3000r3000rminmin离心离心5min5min，倾去上清液，倾去上清液，加入无菌生理盐水洗涤再离心。加入无菌生理盐水洗涤再离心。 2 2将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液通过滤纸过滤，单细胞滤液摇动，以打

6、散菌体。将菌液通过滤纸过滤，单细胞滤液装入试管内，使细胞数约为装入试管内，使细胞数约为108108个个mlml，作为待处理菌悬，作为待处理菌悬液。液。 3 3取取2 24ml4ml制备的菌液加到直径制备的菌液加到直径7cm7cm培养皿内，放入培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W15W紫外线下紫外线下30cm30cm处。在正式照射前，应先开处。在正式照射前，应先开紫外灯预热紫外灯预热10min10min，然后开启皿盖正式在搅拌，然后开启皿盖正式在搅拌下照射下照射101050s50s。操作均应在红灯下进行，或。操作均应在红灯下进行，或用黑

7、纸包住，避免白炽光。用黑纸包住，避免白炽光。 4 4取未照射的制备菌液和照射菌液各取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml0.5ml进行稀进行稀释分离，计数活菌细胞数。释分离，计数活菌细胞数。 5 5取照射菌液取照射菌液2ml2ml于液体培养基中于液体培养基中(300ml(300ml三角瓶三角瓶内装内装30ml30ml培养液培养液) )，120r120rminmin振荡培养振荡培养4 46h6h。 6 6取中间培养液稀释分离、培养。取中间培养液稀释分离、培养。 7 7挑取菌落进行筛选。挑取菌落进行筛选。 （1 1）菌种遗传特性）菌种遗传特性 各菌株因遗传特性不同，对诱变剂敏感性也不一各菌株因遗

8、传特性不同，对诱变剂敏感性也不一 样。样。 （2 2）菌体细胞壁结构）菌体细胞壁结构 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 入细胞。入细胞。 （3 3）环境条件的影响）环境条件的影响 环境条件的影响包括：环境条件的影响包括： 诱变前预培养和诱变后培养诱变前预培养和诱变后培养 温度、温度、pHpH、氧气等外界条件对诱变效应的影响、氧气等外界条件对诱变效应的影响 由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，使链霉菌

9、细胞数量将随着他形式的连续划线，使链霉菌细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，果划线适宜的话，能将链霉菌细胞一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。并测定经培养后，可在平板表面得到单菌落。并测定出其变异率（变异数与观察总个体数的比值）。出其变异率（变异数与观察总个体数的比值）。 挑出变异菌落并移植至斜面上。挑出变异菌落并移植至斜面上。 分离后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突分离后得到的菌落，真正能发生性能变好的所谓正突变个数极少，要从几千万个菌落中选出几个好的，与变个数极少，要从几千万个

10、菌落中选出几个好的，与自然选育中的筛选方法相同。可分为初筛（平板筛选、自然选育中的筛选方法相同。可分为初筛（平板筛选、摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选) )和复筛。和复筛。 筛选的方法：随机乱向筛选筛选的方法：随机乱向筛选 定向筛选定向筛选 突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子筛子”。 初筛：初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。以多为主，尽量扩大筛选范围。 复筛：复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株。

11、选育高产或其他优良菌株。 多级水平筛选：多级水平筛选：由于诱变产生高产突变株的频率很由于诱变产生高产突变株的频率很低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中低，而且实、验误差又很难避免，所以筛选工作中常用多级筛选，一利于优良菌株的获得常用多级筛选，一利于优良菌株的获得 平板菌落预筛平板菌落预筛 根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行根据特定代谢产物的特异性，利用琼脂平板进行筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提筛选和活性粗测的方法，大幅度扩大有效筛选量，提高筛选工作效率。高筛选工作效率。 摇瓶发酵筛选摇瓶发酵筛选 优点：优点：不管种子或发酵过程的生产条件、生理条不管种子或发酵过程

12、的生产条件、生理条件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。件如何，都与发酵罐大生产条件相近，可以模拟进行。缺点：缺点：在突变率小的情况下，如果菌落挑在突变率小的情况下，如果菌落挑取少，很难筛选到理想的突变株取少，很难筛选到理想的突变株 对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培对初筛出来的菌株进行复筛时，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复养法，一般一个菌株至少要重复3535个瓶，培养后个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。的发酵液必须采用精确分析方法测定。 复筛过程中，要结合各种培养条件进复筛过程中，要结合各种培养条件进行筛选，在不同培养条件下进行试验。行筛选，在不同培

13、养条件下进行试验。 1 1、步骤：、步骤：摇瓶培养通常分为初筛和复筛，初筛因菌摇瓶培养通常分为初筛和复筛，初筛因菌株多常常一株菌一瓶，进行振荡培养，培养结束后逐株多常常一株菌一瓶，进行振荡培养，培养结束后逐个进行活性测定，将生产性能高的菌株用沙土管或冷个进行活性测定，将生产性能高的菌株用沙土管或冷冻管保藏。复筛时取出，以一株冻管保藏。复筛时取出，以一株3-53-5瓶，振荡培养后，瓶，振荡培养后，测定活性，以提高精确性。测定活性，以提高精确性。 2 2、优点：、优点：培养条件与发酵罐接近，这样筛选出来的培养条件与发酵罐接近，这样筛选出来的菌容易在大生产中推广。菌容易在大生产中推广。3 3、注意事

14、项：、注意事项：摇瓶的条件要尽量与发摇瓶的条件要尽量与发酵罐接近。且各摇瓶间的培养条件要尽酵罐接近。且各摇瓶间的培养条件要尽量一致（摇瓶型号，装量，瓶塞厚度或量一致（摇瓶型号，装量，瓶塞厚度或瓶口包扎纱布的层数，摇床转数，温度）瓶口包扎纱布的层数，摇床转数，温度）培养基培养基脂肪酶脂肪酶产生菌产生菌透明圈法透明圈法成色圈法成色圈法果胶酶果胶酶产生菌产生菌培养基培养基生长圈法生长圈法抑菌圈法抑菌圈法嘌呤产生菌嘌呤产生菌青霉素青霉素产生菌产生菌一、根据平板菌落生化反应筛一、根据平板菌落生化反应筛选变株选变株2037二、采用冷敏感菌筛选抗生素变株二、采用冷敏感菌筛选抗生素变株加入抗生素加入抗生素不加

15、抗生素不加抗生素三、浓度梯度法筛选法三、浓度梯度法筛选法四、复印技术快速筛选变株四、复印技术快速筛选变株测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法测定不同酵母菌胞内脂肪含量的简单定量法苏丹黑染色1五、琼脂大通量筛选变株五、琼脂大通量筛选变株200摇瓶液体培养寥寥无几产物活性鉴定培养基培养条件调整正交实验设计 1. 1.琼脂平板活性圈法琼脂平板活性圈法 2. 2.纸片法纸片法: :发酵液浓度高时发酵液浓度高时 3. 3.琼脂薄层纸片法琼脂薄层纸片法 4. 4.自动生化仪器分析法自动生化仪器分析法透明圈透明圈变色圈变色圈生长圈生长圈抑菌圈抑菌圈( (水解酶、水解酶、有机酸）有机酸） ( (产酸菌产酸菌

16、) )(工具菌+待检菌)( (抗生菌抗生菌) ) 本组方案采用琼脂平板活性圈法本组方案采用琼脂平板活性圈法中的抑菌圈来测定其活性。中的抑菌圈来测定其活性。 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体 野生型菌株野生型菌株wild type strain wild type strain 原始菌株原始菌株 营养缺陷型营养缺陷型auxotroph auxotroph 人工诱变或自然突变人工诱变或自然突变 原养型菌株原养型菌株prototroph prototroph 回复突变或重组变异回复突变或重组变异 与筛选营养缺陷型有关三类培养基与筛选营养缺陷型有关三类培养基 (1)

17、(1)基本培养基基本培养基MMMM (2)(2)完全培养基完全培养基CMCM (3)(3)补充培养基补充培养基SMSM突变株的表型 检出方法营养缺陷型 补充培养基（auxotroph） 抗性突变型 药物培养基（resistant mutant）条件致死型 培养条件改变（conditional lethal mutant） 诱发突变诱发突变 淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株 检出缺陷性检出缺陷性 鉴别缺陷性鉴别缺陷性 选择合适的诱变剂与诱变方法选择合适的诱变剂与诱变方法 诱变剂和诱变方法都要简便有效诱变剂和诱变方法都要简便有效 主要的诱变剂亚硝基胍主要的诱变剂亚硝基胍, ,紫外线紫外线, ,亚硝酸亚

18、硝酸 诱变方法诱变方法 物理方法物理方法 化学方法化学方法 注意突变率还与诱变剂量有关注意突变率还与诱变剂量有关 1.抗生素法 青霉素法（细菌） 作用于细菌细胞壁的主要成分肽聚糖 制霉菌法（酵母菌） 作用于真菌细胞膜上的甾醇 2.菌丝过滤法 适用于真菌和放线菌 作用于丝状菌的孢子 3.高温杀菌法 适用于芽孢菌类 作用于芽孢菌类的芽孢和营养体 夹 层 培 养 法夹 层 培 养 法 限量补充培养法限量补充培养法 影 印 接 种 法影 印 接 种 法 逐个检出法逐个检出法 需要注意两点 第一 防止菌落扩散和蔓延，在培养基中加入脱氧胆酸钠 第二 为了克服孢子扩散而带来不纯现象，在操作方法上改进。 1 、鉴定方法 一种方法是加入一种物质测定多株缺陷型菌株 一种方法是测定一种缺陷型菌株对许多生长因子的需求情况称为生长谱法 2、营养缺陷型鉴定步骤 1测定缺陷性菌株所需生长因子的类别 2具体测缺陷该类别物质中的哪种因子 3用单一因子进行复证试验 营养缺陷型生