Gpnmb在急性肾缺血再灌注损伤肾脏和抗原提呈细胞的表达

1、Gpnmb在急性肾缺血再灌注损伤肾脏和抗原提呈细胞的表达急性肾损伤 (acute kidney injury, AKI)是临床常见病症 , 具有高患病率和死亡率。 AKI 发病机制复杂 ,炎症和免疫反应在 AKI 的病理生理进展中起重要作 用。巨噬细胞(macrophages, M © )和树突状细胞(dendritic cells, DC)均为抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC),是炎症和免疫反应系统中的重要 成员。有研究证明在 AKI肾脏中,M浸润至肾髓质,它既可引起肾脏损伤,也能促 进肾组织修复 , 但它所起的具体作用还不完全清楚。 在临床

2、上 ,缺乏早期诊断指标 致使诊断及治疗延迟是 AKI 至今死亡率仍高的一个重要原因。 目前最常用的检测 指标是血肌酐 (serum creatinine, SC r) 、血尿素氮 (blood urea nitrogen, BUN) 及血清肌酐清除率 (creatinine clearance rate, CCR), 它们检测 AKI 的特异性 和敏感性都不高。我们以前的研究发现肾脏损伤分子 -1(kidney injury molecule-1, Kim-1) 是一个高特异性的 AKI 检测指标。有报导认为中性白细胞明胶酶相关脂质运载蛋 白(n eutrophil gelati nase-a

3、ssociated lipocali n, NGAL),白介素-18(interleukin-18, IL-18) 和脂肪酸结合蛋白 (fatty acid binding protein, FABP也可以作为AKI的检测指标。但所有这些标志物尚处于评估阶段,距临床应 用仍有一段距离。所以 , 目前仍然缺乏一个或一组高特异性高敏感性的指标可早期诊断 AKI, 并指导后续治疗非转移性黑色素瘤糖蛋白 (glycoprotein non-metastatic mela nomab, Gpn mb是一种I型跨膜糖蛋白。它又称为造血生长因子诱导的神经、树突状激肽(hematopoietic growth

4、 factor in ducible n eurok inin, HGFIN)细胞相关的硫酸肝素糖蛋白整合素 (dendritic cell-associated heparin sulfate proteoglycan-dependent integrin ligand DC-HIL) 、骨激肽 (osteoactivi n,OA)。它的胞外段包括一个肝素结合域、一个整合素精氨酸甘氨酸门冬氨酸基序、以及一个多囊肾序列。Gpnm在多种组织细胞中表达，如胚胎神经系统、胚胎肾单位、皮肤基底层、 毛囊生发细胞、成骨细胞、破骨细胞、阴、视网膜色素上皮细胞和 DC近年来的研究表明,Gpnmb可能抑制册的

5、炎症反应和T淋巴细胞的活化，但它是否在急 性肾损伤中起作用目前还不清楚。 缺血再灌注损伤 (ischemia/reperfusion, I/R) 是引起 AKI 是常见原因之一。急性肾 I/R 动物模型是长期公认的 AKI 模型。我们以前的研究对小鼠和大鼠 I/R模型肾脏进行表达性差异显示分析，发现Gpnm基因在急性I/R模型肾脏中 升高明显，而Gpnm在受损肾脏中的具体表达位置并不清楚。有体外研究表明 Gpnm基因在MO和DC中表达,Gpnmb蛋白分为膜型和分泌型，但Gpnm在尿液中 的表达情况目前尚无报导。所以我们进一步检测Gpnm在急性肾I/R动物模型肾脏和尿液中的表达水平 以期能更深入

6、了解 AKI 损伤和修复的机制 , 也同时寻求更实用的 AKI 早期诊断指 标；并在体外实验中，进一步探讨Gpnmb在 APC及肾脏细胞中的表达特点。本论 文分为两部分：第一部分为体内实验 , 建立小鼠和大鼠急性肾 I/R 模型, 应用 Northern blot 、实时荧光定量 PCR(quantitative ploymerase chain reaction, qPCR).原位杂交、免疫荧光染色及流式细胞仪等技术，观察对照组和I/R组动物 肾脏中GpnmbS达水平,并用免疫荧双染色对Gpnm在肾脏的表达进行定位，同时 用Western blot检测Gpnmb在对照组和I/R组动物尿液中的

7、表达。第二部分为 体外实验 , 原代培养小鼠和大鼠骨髓源性巨噬细胞 （bone marrow derivedmacrophages, BMMcp）和小鼠骨髓源性树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDC）,并结合小鼠巨噬细胞株（RAW264.7细胞）,观察Gpnmb在APC （M©和DC）的表达特点，并对其作用进行初步探讨。我们还原代培养了小鼠和大鼠近端肾小管上皮细胞 （proximal tubular epithelial cells, PTC）, 并利用不同种属不同肾小管节段的细胞株 （如 LLC-PK1、 NRK 52 e、

8、M D C、K MIMCD3、） 人肾胚胎细胞株 （293） 及人肾癌细胞株 （769-p）, 研究 Gpn m是否在肾小管上皮细胞、肾癌细胞及肾胚胎细胞表达。目的：建立小鼠和 大鼠急性肾I/R模型,观察在对照组和I/R组动物肾脏中GpnmbnRN和蛋白表达 水平（体内实验）,并通过原代培养BMM , BMD和 PTC及巨噬细胞株及各种肾小 管上皮细胞株、肾癌细胞株及肾胚胎细胞株（体外实验）,观察Gpnml这些细胞中 的表达特点,初步探讨Gpnmb勺作用。方法：1、建立小鼠和大鼠急性肾I/R模型： I/R 组小鼠和大鼠予以双侧肾蒂钳夹阻断血流 30分钟,对照组（即假手术组）仅切 开皮肤和肌肉

9、, 不作肾蒂血管钳夹。分别于术后第 1、 2、 3、 4、 5、 7、 14天处死小鼠和大鼠。留取尿液和血液 , 收集处理肾组织标本。通过检测血 . 肌酐, 观察，肾织织光镜形态学及 Kim-1 和 vimentin 的免疫荧光染色对 I/R 模型进行览鉴定。2、检测Gpnmb在对照组和I/R组肾脏及尿液中的表达：采用Northern blot, qPCR测Gpnmb的 mRN表达水平；采用原位杂交定位 Gpnmb mRN在肾脏中的 表达部位；米用免疫荧光染色观察 Gpnml:蛋白在I/R组肾脏中表达的动态变化； 采用免疫荧光双染色及流式细胞技术进一步确定Gpnm!在I/R组肾组织中APC（M

10、©和DC）和T淋巴细胞上的表达,并通过Western blot检测Gpnmi在对照组和I/R 组尿液中的表达。3、原代培养小鼠和大鼠BMMcp通过免疫荧光染色和流式细胞 仪检测 腐 表面标志物(小鼠：F4/80和CD11b大鼠：CD68),来验证BMMcp®养 成功与否。通过以上技术检测 Gpnm在BMMc的表达。然后用不同细胞因子将 BMMc刺激分化成M1型和M2型BMMcp通过检测M1 型和M2型Mcp的表面标志物及所表达细胞因子,来验证M1型和M2型BMMc分 化成功与否。再通过免疫荧光染色、流式细胞仪、Western blot及ELISA等技术检测Gpnm在M1型和

11、M2型BMMc表达的特点。4、培养小鼠巨噬细胞株 (RAW264.7), 分成两组：一组用脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 处理 24 小时 (LPS组)，另一组不用LPS处理(对照组),采用qPCR. Western blot及ELISA等 技术,观察Gpnm在LPS组及对照组RAW264.7细胞中的表达特点。5、原代培养小鼠BMDC能过免疫荧光染色和流式细胞仪检测小鼠 DC的表面 标志物(CDllc),来验证BMD(培养成功与否。再通过同样方法检测 Gpnmb在小鼠 BMD(中的表达。6、原代培养小鼠和大鼠PTC并培养各不同种属不同节段肾小 管的细胞株(如LLC-

12、PK1 NRK52e、MDCK MIMCD3)人肾胚胎细胞株(293)及人 肾癌细胞株(769-P),通过qPCF或免疫荧光染色检测Gpnmb在以上细胞的表达。用红色荧光标记的Gpnmb (Gpnmb-Fc-Cy3处理原代培养的小鼠和大鼠 PTC, 检测PTC是否结合或吞噬外源性的Gpnmb结果：1、小鼠和大鼠急性肾I/R模 型建立成功：(1)SCr :与对照组相比，1/R组小鼠和大鼠SCr在术后第1天明显 升高,于第2天起下降,至第7天基本恢复到正常水平。(2)光镜(HE染色):对照 组肾脏组织结构基本正常 ,I/R 组肾组织可见肾小管肿胀、 坏死、脱落, 管腔扩张 , 肾间质炎性细胞浸润。

13、(3)Kim-1( 免疫荧光染色 )：对照组肾脏组织中 ,Kim-1 很少表达；在 I/R 组 肾组织 ,Kim-1 表达升高。 (4) Vimentin( 免疫荧光染色 ) ：对照组肾脏组织中,Vimentin很少表达，1/R组肾组织,Vimentin表达升高。2、Gpnml在小鼠和大 鼠急性肾I/R模型中的表达升高；(1)Northern blot 、qPCR和原位杂交结果示： 对照组大鼠肾脏中Gpnmb mRN表达低,而在I/R组大鼠肾脏中Gpnmb mRN的表 达显著增高。Gpnmb mRN主要表达在肾髓质外部外缘 (outer stripe of outer medulla,OSOM

14、的浸润细胞中。(2)免疫荧光染色和流式细胞仪结果示：对照组大鼠肾脏 中,Gpnmb蛋白表达低，而在I/R组大鼠肾脏中明湿增多。Gpnmk主要表达在OSOM 的浸润细胞中。I/R损伤第2天的肾脏中,Gpnmb细胞位丁 OSO的肾间质中,至I/R损伤第4 天，大部分Gpnmb细胞进入了 OSO的肾小管管腔内。肾小球和肾小管上皮细胞 未见Gpnmb表达。Gpnm与眶标志物F4/80、CD68, MHC召CD86等共表达； Western blot 结果示：对照组小鼠尿液中 Gpnml表达水平很低,而I/R组小 鼠的尿液,Gpnmb在术后第1天和第2天表达明显升高,第3天恢复到正常水平。3、Gpnmb

15、在原代培养的小鼠和大鼠BMM中表达：(1)免疫荧光染色结果示：小鼠BMM中Gpnm与F4/80共表达；大鼠BMM中,Gpnmb与CD68共表达。(2) 流式细胞仪结果示：原代培养小鼠BMM中有94.7 ± 6.1%细胞表达CD11b在CD Ilb+BMM©中Gpnm阳性率为75.1 士 4.8%。(3)MO型BMM (未分化型)和M2型 BMM的Gpnml总表达量没有差别，但M1型BMMc的 GpnmbS达总量增多。相对于M2型BMIM , Ml型BMIM细胞培养液中GpnmbS达高,而细胞蛋白裂 解液中的表达较少。根据 Gpnmb在 BMIM的表达特点,BMMcp可分为三

16、种类型： Gpnmb BMM；小单核 Gpnmb+BMJM；大多核 Gpnmb+BMM。4、Gpnml在 RAW264.7 巨噬细胞株表达：(1)qPCR和Western blot结果示,相对于对照组，Gpnmb mRNA 表达和蛋白表达在LPS组增高(p<0.05)。(2)免疫荧光染色结果示,有三种类型的RAW264.7细胞：Gpnmb- RAW264.7 细胞；小单核 Gpnmb+RAW264细胞；大多核 Gpnmb+RAW264细胞。在对照组 中,Gpnmb多表达在细胞核周围：在 LPS组中,小单核Gpnmb+RAW264细胞的 Gpnm先进入细胞内小泡,经细胞膜释放到细胞

17、外；而在大多核 Gpnmb+RAW264.7 细胞中Gpnmt的表达仍在细胞核周围。5、Gpnmb在原代培养的小鼠BMD(表达： 免疫荧光染色显示,我们培养的细胞中大部分表达 CD11c, Gpnmb与CD11c有 共表达。(2) 流式细胞仪结果示 ,在我们培养的细胞中 ,有70.28±8.25%细胞为 CD11c 阳性；33.51 ± 2.32%CD11c细胞为Gpnmb阳性6、Gpnmbi原代培养的小鼠和大 鼠PTC各肾细胞株表达很低： 相对于RAW264.细胞,Gpnmb mRN在原代培 养PTC及各肾小管细胞株(如LLC-PK1 NRK 52e MDCK. MIMCD3)人肾胚胎细胞 株(293)