分子生物学材料和方法杂烩

1、1. 小鼠腹腔原代巨噬细胞的诱导及鉴定(1) 复苏小鼠腹腔原代巨噬细胞，37、5%CO2孵箱常规培养；(2) 培养8-12h后在培养体系中分别加入PMA刺激原代腹腔巨噬细胞36h；以20ng/ml IL4刺激原代腹腔巨噬细胞36h；(3) 选取CD206作为M2型巨噬细胞的标记物；(4) 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD206的表达，qRT-PCR法检测巨噬细胞CD206和Arg-1的表达。2. 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD206的表达（1） 按步骤1分别获得的PMA诱导的腹腔巨噬细胞和IL-4诱导的腹腔巨噬细胞；（2） 经0.25%胰酶消化后收集各组巨噬细胞，计数，用预冷的PBS将细

2、胞浓度调整到2×106/ml，离心定容至100l；（3） 在细胞悬液中分别加入5l PE anti-mouse CD206（MMR）（0.2mg/ml），4避光孵育30min；（4） 用1ml预冷的PBS洗2遍，4，3000rpm，离心5min，吸去上清；（5） 用200l预冷的PBS重悬细胞，或用1%多聚甲醛溶液固定，流式细胞仪检测各表面分子的表达。3. M2型巨噬细胞与胃癌共培养（1） 以IL-4诱导小鼠腹腔巨噬细胞48h后，形成的M2型巨噬细胞经0.25%胰酶消化，计数并更换新鲜培养基，以2×10*6/ml平铺于六孔板中；将纯化胃癌细胞加入培养体系中，在37、5%CO

3、2培养箱中培养，36h收集上清用于细胞因子和NO分泌的检测。（2） M2型巨噬细胞与胃癌细胞共培养实验分组：1：M2型巨噬细胞+None2：M2型巨噬细胞+miR-Ctrl胃癌细胞3：M2型巨噬细胞+miR-142-5p过表达胃癌细胞4：M0型巨噬细胞+miR-4 细胞培养上清的制备： 共培养36h后，收集上清于离心管中，4、12,000rpm，离心5min，立即进行细胞因和NO的检测或分装后储存于-80冰箱中。1.1 人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的培养1.1.1 活细胞计数用无血清培养基把悬液稀释到200-2000个/ml，将0.1ml的0.4%的台盼蓝溶液加入0.1ml的细胞悬液中

4、，轻轻吹匀。数分钟后，用血球计数板计数细胞。染成蓝色的细胞是死细胞（活细胞排斥台盼蓝）1.1.2 M2型巨噬细胞的体外诱导取对数生长期的THP-1细胞，将其传代接种于六孔板中，控制细胞数约1×10*5/ml每孔。向培养基中加入45ng/ml IL-4，继续培养6天，收获不同激活状态的巨噬细胞进行后续实验。1.1.3 细胞上清的制备用无菌Ep管收集不同激活状态下巨噬细胞分泌上清，4、3000rpm离心20min，收集上清，分装后储存于-80冰箱中。1.2 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测胞内IL-10的表达水平（1） 刺激细胞：将刺激剂BD GolgiPlug T

5、M在室温下解冻，于每毫升细胞培养液中加入1l刺激剂，充分混匀，将细胞置于5%CO2、37培养箱中继续培养不超过12小时。（2） 收获细胞：将细胞悬液移入Ep管中，4000rpm×5min离心，小心弃去上清，PBS洗涤3次，获得细胞沉淀。1.1 骨髓来源巨噬细胞M2型巨噬细胞的建立将分离到的骨髓细胞用RPMI1640 培养液制备细胞悬液，加入75cm2培养瓶中，37、5%CO2温箱中孵育24h，培养箱中培养2h，吸取未贴壁细胞，1500rpm，离心5min，加入10cm玻璃皿中，然后向其加入含100ng/ml M-CSF的RPMI1640完全培养液，37、5%CO2培养箱内培养7d，收

6、获贴壁细胞，细胞计数，调整细胞密度为3×10*6/ml，加入六孔细胞培养板，分别加入100ng/ml M-CSF、40ng/ml IL-4和Transwell小室（4m，内铺单层胃癌细胞）建立M2-like、M2a、TAM三种M2表型巨噬细胞。1.2 流式细胞术1） 将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，1500rpm离心5min，弃上清液。2） 以冷PBS离心洗涤，弃上清液。3） 加入PBS稀释的荧光素标记抗体200l。用微量移液器轻轻吹打混匀，4或冰上孵育30min-1h4） 离心弃去上清液5） 加入冷PBS 1ml，离心洗涤3次，除去未结合的多余抗体成分。6） 向细胞中加入冷PB

7、S 500l，吹打混匀，置流式管中，4避光保存，待测。参照体外培养的经典方法，IFN-及LPS可将骨髓来源巨噬细胞诱导成M1型，IL-4将其诱导M2型，不同类型巨噬细胞的功能差异与精氨酸代谢不同有关，两种代谢途径关键酶iNOS和Arg-1相互竞争，分别介导巨噬细胞的抗感染和组织损伤修复的功能。因此通过WB分析IL-23处理M2型巨噬细胞后iNOS和Arg-1的表达水平变化，来评价巨噬细胞表型是否发生了转化。1. 胃癌细胞/THP-1共培养体系的建立（1） 收获条件培养基：诱导M1及M2型巨噬细胞结束后，更换含RPMI1640/2%FBS培养基，继续培养24h，收集细胞上清，过滤后保存于-80，

8、使用前5过夜融化；（2） 建立条件培养基介导的间接共培养体系：本部分实验研究胃癌细胞的增殖实验，均使用50%DMEM培养基+50%巨噬细胞条件培养基，培养3天后，更换成DMEM完全培养基（3） 建立Transwell小室介导的间接共培养体系，本部分实验研究巨噬细胞相关实验均使用Transwell间接共培养体系，上层加300l 10*5胃癌细胞，下层为800l 3×10*5THP-1，共培养指定时间后收获THP-1细胞。2M2型巨噬细胞的诱导（1） 按1×10*6/ml的细胞密度接种THP-1细胞于六孔板中，加PMA刺激6h；（2）6h后加20ng/ml IL-4和20ng/

9、ml IL-13再处理18h，所得细胞即为M2型1.1 肿瘤细胞与巨噬细胞共培养实验（1）2% FBS/DMEM稀释肿瘤细胞，加入到巨噬细胞的培养皿中混匀（30000cells/well/ml）；间接培养时，先在培养皿中加入1.4ml 2%FBS/DMEM，然后插入跨膜培养系统，在多聚碳酸膜上方加入稀释好的肿瘤细胞（30000cells/0.7ml）。跨膜培养系统是一种布满无数8m微孔的多聚碳酸膜，可溶性细胞因子可自由通过该膜；（2）37孵箱共培养48h后收集细胞，进行双重免疫染色。1. 胃癌细胞与巨噬细胞混合瘤模型用1：3的比例将巨噬细胞和胃癌细胞混合皮下接种6周龄雌性BALB/c小鼠，每组

10、6只。40天后脱颈处死小鼠；1. 实验分组：组1：单核细胞THP-1单独培养组 组2：胃癌细胞单独培养组 组3：THP-1与胃癌细胞混合培养组2. 利用生长曲线法研究TAM对胃癌细胞生长的作用 各实验组分别以10*5cells/ml、10*6cells/ml两数量级的细胞密度进行培养，以上使用6孔板，每组接种3孔，每孔加入RPMI1640（10%胎牛血清+1%双抗）培养基2ml，37、5%CO2条件下于培养箱中培养。分别于培养初始、24小时、48小时、72小时，利用血球计数板计数各组细胞数，每组计数3孔，每孔重复计数2次取平均值，根据计数结果，以单位细胞数（cells/ml）为纵坐标，时间为横

11、坐标绘制生长曲线，比较各组之间的生长情况。3. 通过流式细胞术研究THP-1细胞的TAM转化效应使用六孔板，组1和组3分别各接种6孔，采用以下：THP-1：1×10*5cells/ml，miR-142-5p过表达胃癌细胞：2×10*5cells/mlTHP-1：1×10*5cells/ml，miR-Ctrl胃癌细胞：2×10*5cells/ml每孔加入RPMI-1640（10%胎牛血清+1%双抗）培养基2ml，37、5%CO2条件下于培养箱中常规培养。培养72小时候收集6孔板中的细胞，以抗人CD206-PE流式抗体标记细胞，进行流式细胞检测。1. 巨噬细

12、胞的诱导及流式细胞仪检测CD206表面抗原表达（1） 取对数生长期的人单核细胞株THP1细胞，以1×10*6/孔接种于六孔板中，约2.5ml/孔；（2） 参照Higai、Tahan等参考文献23-34人的方法并结合预实验结果，加入佛波酯PMA50ng/ml，放入培养性孵育48h，诱导巨噬细胞，此时细胞已贴壁生长，且细胞形态发生变化；-（3） 吸尽培养基，用灭菌的PBS缓冲液清洗细胞3次；（4） 在六孔板中加入0.5ml/孔含0.25%EDTA的胰酶，放入培养箱中孵育15-20分钟消化细胞；（5） 加入培养基终止消化，离心管收集细胞，3000rpm离心5min，弃上清；（6） 用预冷灭

13、菌的PBS洗涤消化下来的细胞2次，收集细胞，移入离心管中，3000rpm离心5min×2次，弃上清；（7） 取1×10*6/ml细胞悬液100l移入5ml流式上样管中，加入细胞固定液室温固定30min，3000rpm离心5min，弃上清；（8） 加入1；10用PBS缓冲液配制的穿膜液，室温下静置30min，3000rpm离心5min，弃上清；（9） 用预冷灭菌的PBS缓冲液清洗细胞，3000rpm离心5min×2次，弃上清；（10） 加入PE-CD206流式抗体20l，避光室温反应30min，加入PBS缓冲液500l。上流式细胞仪检测。2. M2型巨噬细胞的诱导活

14、化（1） PMA诱导48小时后的巨噬细胞分成2组，M0组、M2组（2） 吸尽培养基，用灭菌的PBS缓冲液清洗细胞2次，消除PMA对细胞的影响，洗去未贴壁细胞；（3） 参照文献25-28方法并结合预实验结果，M2组加入含IL4 15ng/ml的10%胎牛血清RPMI-1640培养基，置于培养箱中孵育48h，诱导成M2型巨噬细胞，M0组继续加入PMA50ng/ml的10%胎牛血清RPMI1640完全培养基。3. 胃癌细胞与巨噬细胞非接触式共培养体系的建立（1） 将处于对数生长期的胃癌细胞用0.25%胰酶消化，3000rpm离心5min，弃上清；（2） 离心管中加入完全培养基重悬细胞，以1×

15、;10*5/ml浓度重悬，取3块共培养板，接种500l/孔于24孔的Transwell培养板（滤膜孔径0.4m）下层小室中孵育24h；（3） 将不同激活途径的巨噬细胞消化后分别收集，以5×10*5/ml的浓度接种200l/孔于上层小室中进行培养。放入37培养箱中孵育24h、48h、72h（4） 组别分别设为单独培养组（BGC823细胞+培养基）、M0组（BGC823细胞+PMA单独诱导的巨噬细胞），M2组（BGC823细胞+M2型巨噬细胞）。每组设4个复孔。4. MTT法检测胃癌细胞的增殖（1） 共培养24h、48h、72h后分别取出1块培养板，在Transwell小室下室中加入MT

16、T（5mg/ml）50l/孔，37，5%CO2培养箱中继续孵育4h；（2） 取出培养板，镜下可见紫色结晶物，小心吸弃上清，避免吸入紫色结晶物，加入DMSO100ul/孔，震荡仪振荡10min，使结晶物充分溶解。每组设5个复孔（3） 在490nm波长的酶联免疫测定仪上检测各组OD值。根据以下公式计算细胞增殖率：增殖率（%）=（实验组OD值-单独培养组OD值/单独培养组OD值）×100%。以时间为横轴，OD值为纵轴，连续3天绘制细胞生长曲线图。实验重复3次。5. Transwell小室检测细胞侵袭能力（1） 实验前1天降Matrigel胶置于4冰箱中融化过夜，实验所用的枪头、Transw

17、ell小室（滤膜孔径0.4m）置于-80冰箱预冷；（2） 铺胶：将Matrigel胶用无血清RPMI1640培养基1：4稀释，取60l/孔铺于Transwell小室的上室面，37孵育过夜，使Matrigel胶变成胶冻状。所有操作均在冰上进行。（3） 水化基底膜：吸出小室中残余液体，每孔加入80l/孔无血清1640培养基，37孵育30min，吸取培养基；（4） 将与不同激活途径的巨噬细胞共培养后的胃癌细胞用无血清培养基以5×10*6/ml的浓度接种200l/孔于上层小室，下层小室加入含10%FBS的完全培养基500l，37培养24h；（5） 吸尽培养基，用棉签小心擦去Transwell

18、小室的下室面未穿透滤膜的细胞，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛，室温固定20min，吸尽甲醛，PBS清洗3次；（6） 风干后用0.3%结晶紫染色20分钟，吸尽结晶紫，PBS清洗3次；（7） 风干后在显微镜下观察滤膜下表面蓝紫色胞浆的细胞，随机取10个400倍视野下分别技术，取均值。以穿膜细胞的数目表示细胞的侵袭能力，实验重复3次。图-1 miR-142-5p在76对胃癌及癌旁正常组织中的表达。（A）与癌旁正常组织相比，miR-142-5p在51例胃癌组织中低表达，在25例胃癌组织中低表达或表达差异不大；（B）76例胃癌组织中，miR-142-5p的相对表达值均明显低于癌旁正常组织 （p0.05

19、表-1 75对胃癌组织中miR-142-5p（T/N）的表达与临床病理特征的相关分析变量例数MiR-142-5p(T/N)表达水平（2-Ct）X2P值高低性别0.7120.448男542925女21912年龄（岁）0.6530.4766027121560482622病理分化0.1280.768高/中分化1367中/低分化623230肿瘤部位3.3630.339胃体532胃底312胃窦472720贲门20713TNM分期6.3340.017I/II期29209III/IV期461828侵犯浆膜0.1080.801是542826否211011淋巴结转移6.5530.016是481929否27198

20、 远处转移1.2290.309M1936M0663531术后转移5.8560.026是582533否171341. II型肿瘤相关巨噬细胞的诱导及鉴定1.1 M2的诱导选择对数生长期的THP-1细胞，待其葡萄串样状态达培养体系中80%以上时，以移液管将其轻柔吹散，重置细胞密度达1-4×10*6，按5nM的浓度在每一培养体系中加入PMA，轻轻混匀，待其于37、5%CO2培养性中作用48h后，THP-1由悬浮生长转变为贴壁生长的巨噬细胞；之后按20ng/ml的浓度在每一培养体系中加入人重组IL-4，轻轻混匀，再次于37、5%CO2培养箱中培养24h，此时培养体系中细胞形态较24h前未见明

21、显变化。1.2 M2的流式细胞术鉴定以0.25%胰酶消化传代，37孵育5min，待细胞脱壁后加入新鲜的含小牛血清的培养液中止胰酶反应，抽提重悬细胞，1200rpm离心5min后得到细胞沉淀，加入新鲜培养液抽提重悬细胞，对细胞悬液进行计数。提取12×10*7个细胞重新混匀，2000rpm离心5min后去上清，PBS重悬细胞，重新混匀，如此重复3次；弃上清后加入4%多聚甲醛室温固定1520min，2000rpm离心5min后除去多聚甲醛，重复PBS冲洗2次，离心。加入含5%BSA的封闭液封闭1h，重新混匀后2000rpm离心5min除去上清。对需要鉴定的细胞进行分组如下：未经任何药物处理

22、的THP-1细胞（空白组）；经佛波酯（PMA）作用48h的THP-1细胞；经PMA、IL-4序贯作用总计达72h的细胞。分组加入预先按说明书要求稀释好的一抗PE-CD206，混匀后于4孵育1-1.5h，重新混匀后于室温避光孵育45-60min。实验过程中设置本底管（只加入二抗，特异性一抗以PBS代替），每组分成三个复管，上机检测。1.1图-1镜下THP-1，M0，M2型巨噬细胞形态观察：人单核细胞THP-1在经佛波酯PMA48h、重组人白介素4（IL-4）24h作用后，镜下形态观察显示：处理所得M2型巨噬细胞形态与THP-1有显著差异：由悬浮生长变为贴壁生长，由类圆变为不规则并伸出伪足，细胞间

23、也形成了丰富连接。M2与未激活的M0相比，前者形态更为不规则，伪足更多，且细胞间连接更为丰富。1.2II型肿瘤相关巨噬细胞的诱导及鉴定 根据既往研究结果支持，我们采用人单核细胞白血病THP-1细胞在经佛波酯48h、重组人白介素4(24小时)序贯总计作用72h后，采用流式细胞仪检测诱导所得的贴壁细胞表面的CD206标记物表达比例。图2.流式细胞仪检测THP-1细胞处理后CD206的表达情况。1.3 ELISA试剂盒检测细胞上清中IL-10/IL-12的分泌1. 包板：在Costar9018ELISA板中，每孔加入100l预先稀释好的捕捉抗体。封板。4孵育过夜。使抗体充分结合在ELISA板上。2.

24、 将液体全部吸出，倒扣于吸水纸上吸净残留液体，快速加入大于250l的wash buffer（1×PBS，0.05%Tween-20），室温孵育2min，以增强清洗效果。重复洗涤5次。3. 用去离子水稀释分析缓冲液（试剂盒配套）。每孔加入200l，室温孵育1h。4. 同2，重复洗涤五次。5. 用1×分析缓冲液二倍梯度稀释标准品，按照浓度由大到小的顺序将100l标准品稀释液加入到相应的孔中。同时将100l待测样本也加入到合适的孔中。封板，室温孵育两小时，或4过夜。6. 同2，重复洗涤五次。7. 用1×分析缓冲液稀释检测抗体。每孔加入100l稀释好的检测抗体。封板，室温

25、孵育一小时。8. 同2，重复洗涤五次。9. 用1×分析缓冲液稀释亲和素标记的辣根过氧化物酶，每孔加入100l。封板，室温孵育30min。10. 重复步骤2，共洗涤7次。11. 每孔加入100l底物溶液，封板，室温孵育15min。12. 每孔加入50l终止液。13. 酶标仪450nm读取各孔数值。14. 用标准品的数值绘制标准曲线，计算出待测样品的浓度。1. 单核细胞、巨噬细胞和胃癌细胞SGC7901的共培养（1） 吸出胃癌细胞的全部培养基，加入PBS磷酸盐缓冲液2ml洗1遍；（2） 吸走液体，滴加含EDTA的胰酶消化液1ml，边消化，边镜下观察；（3） 当大部分胃癌细胞悬浮后，滴加R

26、PMI 1640细胞培养基1ml终止消化，将细胞悬液移入15ml离心管，并添加PBS磷酸盐缓冲液2ml，离心1000rpm，5min；（4） 移去离心上清液，加PBS磷酸盐缓冲液1ml，轻轻吹打悬浮混匀；（5） 胃癌细胞计数，方法同单核细胞计数，取1×10*5个胃癌细胞接种在transwell共培养板小室上，将小室放在培养诱导单核细胞的六孔板中，建立共培养系统；（6） 上室（孔径为0.4m）接种胃癌细胞，下室分别是单核细胞，经GM-CSF诱导的M1型巨噬细胞，经M-CSF诱导的M2型巨噬细胞，不接种细胞。分别标记为单核细胞组、M1组、M2组和空白对照组。（7） 每天在下室更换1/3培

27、养液，连续5天，台盼蓝染色法检测胃癌细胞的活细胞数。2. transwell共培养系统建立胃癌细胞生长曲线（1） 按照步骤1中transwell共培养方式，上室（孔径0.4m）接种胃癌细胞1×10*5个，下室分别接种2×10*5个单核细胞、经GM-CSF诱导的M1型巨噬细胞、经M-CSF诱导的M2型巨噬细胞，以及不接种细胞；（2） 记为单核细胞组、M1组、M2组和空白对照组；（3） 设立5个时间点，每个时间点又设6个复孔；（4） 每隔24小时弃掉培养基，PBS洗3遍后用胰蛋白酶消化，边消化，边镜下观察，制备胃癌细胞悬液，用台盼蓝染色计活细胞数；（5） 连续上步操作5天，以时

28、间为横轴，胃癌细胞数为纵轴做细胞生长曲线。3. transwell共培养系统检测胃癌细胞侵袭力（1） 应用孔径是8m的上室和6孔培养板（下室）建立侵袭模型；（2） 上室内铺基质胶400g，并分别接种胃癌细胞1×10*5个。下室分别加入胃癌细胞和单核细胞或巨噬细胞的共培养上清2ml。分别记为单核细胞组、M1组、M2组和空白对照组；（3） 24小时后取出上室，用棉签轻轻擦掉上室内表面的细胞和基质胶；（4） 将上室置于95%乙醇中固定10分钟；（5） 在倒置显微镜下计数上室外表面的胃癌细胞数，以相对穿膜细胞数来表示胃癌细胞的侵袭力，每个样本在20×下取5个视野计数，取平均值进行比

29、较。1 单核-巨噬细胞的极化（1） 分离后的单核细胞培养5天后，加入不同的极化刺激因子，极化成不同状态的巨噬细胞。（2） 加入20ng/ml IL4，轻摇24孔培养板，混匀后培养48小时候极化为M2型巨噬细胞2. 极化后巨噬细胞的鉴定，ELISA法检测（1） 包被：加一定量的包被缓冲液，用洗涤液冲洗3次，每次3分钟。（2） 加样：加一定比例稀释的待测样品100l于上述所述的包被缓冲液中，置于37温箱中孵育1小时，然后洗涤3次。同时做空白孔，阴性对照孔。（3） 加酶标抗体：于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体100l，37温箱中（不含CO2）孵育30min，洗涤3次（4） 加底物液显色：于各反应孔

30、中底物液100l。3730min。（5） 终止反应：于各孔中加入终止液50l。（6） 结果判定：于白色背景下颜色越深，阳性程度越高，以此来定性观察结果。借助酶标仪，测得450nm处的吸光度值，定量分析结果。3. 不同极化状态的巨噬细胞对胃癌细胞侵袭的影响（1） 实验前一天将基质胶从-80冰箱中取出，在4冰箱中过夜解冻；（2） 实验前将枪头在冰上预冷半小时，4条件下将基质胶和无血清培养基按1：8的比例混合，取40l加入Transwell上室中，放入37温箱中孵育4.5小时，此间不断观察，出现“白色”时，提示已变成固态；（3） 水化：吸出上室中的残余液体，每孔加入70l无血清高糖DMEM，37温箱

31、中孵育，30分钟弃去；（4） 待胃癌细胞长到80%时，用0.25%胰蛋白酶消化胃癌细胞，显微镜下观察，细胞间隙增大时终止消化，用无菌PBS洗去残余胰蛋白酶，用含1%BSA重悬，调至合适的细胞密度（1.5×10*5细胞/ml）；（5） Transwell上室中加入200l细胞悬液，下室中含有不同极化状态的巨噬细胞及其上清液，进行共培养；（6） 37、5%CO2温箱中孵育36h，期间不断观察，是否出现气泡，出现及时用枪头小心去除。（7） 36小时候取出小室，用棉签擦去上室面基质胶及胃癌细胞，用PBS洗涤，染色前将膜风干，1%结晶紫室温染色20分钟后，PBS洗涤晾干后显微镜下观察，技术。（

32、8） 随机选取400倍镜下4个视野进行计数、判断，拍照并进行统计分析。4. 不同极化状态的巨噬细胞对胃癌细胞迁移的影响（1） 从健康人外周血分离单核细胞极化成不同状态的巨噬细胞；（2） 培养胃癌细胞，置于孵箱中培养至胃癌细胞铺满培养瓶底部80%时，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后，用培养基重悬后台盼蓝染色计数，按照1×10*5细胞/ml含人血的培养基接种至无菌六孔板中；（3） 取不同极化状态的巨噬细胞上清液，4、12,000g，离心，取上清，0.22m无菌滤器过滤备用；（4） 待细胞长满单层后，用无菌1ml微量加样枪头，划出宽约1mm的无细胞区域，用无血清培养基洗涤，除去脱落的细胞及

33、坏死细胞，在六孔板背面用记号笔画出三道垂直于划痕的标记线，以保证之后在同一位置进行观察拍照。追加M1极化状态的巨噬细胞上清液、M2极化状态的巨噬细胞上清液及未极化的单核细胞上清液2ml，在0小时在显微镜下观察拍照记录，于培养24小时后再次在倒置显微镜下观察拍照，观察。5. 不同极化状态的巨噬细胞对胃癌细胞增殖影响（1） 接种细胞：常规培养胃癌细胞，37、5%CO2培养箱中培养，至胃癌细胞铺满培养瓶底部80%时，无菌PBS洗涤2遍，除去坏死细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后，用完全培养基重悬后台盼蓝计数，按照1×10*5细胞/ml用完全培养基重悬，充分混匀后，接种至无菌96孔板中，

34、每加6孔混匀一次，每孔体积为200l。（2） 培养细胞：在细胞中添加不同的极化状态的巨噬细胞上清液（M0,M1,M2；按照50，100l的比例添加，设置一定的浓度梯度，设置5个复孔），在温箱中常规培养细胞48h，倒置显微镜下观察。（3） 呈色；取出培养板后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，无菌PBS配制）10l，继续培养4小时，小心吸去培养孔中的液体，小心PBS洗涤2次，再加入含MTT的培养液。（4） 终止培养，小心吸去孔内培养液；（5） 每孔加入150l二甲基亚砜，置于酶标仪中低速震荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪OD450nm处测量各孔的吸光值。设置调零孔：培养基、MTT、二甲基亚

35、砜加药孔：含加有胃癌细胞和巨噬细胞上清液的培养基、MTT、二甲基亚砜对照孔：含加有胃癌细胞的培养基、MTT、二甲基亚砜操作过程中注意无菌操作，防止细菌导致的MTT比色OD值的升高，造成假阳性或假阴性。6. Western-Blot方法检测蛋白材料：ECL发光试剂盒（），PVDF膜（），（1） 将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的滤纸晾干。配制分离胶：配制浓缩胶：（2） 灌入2/3的分离胶后应立即用双蒸水封胶，在分离胶和双蒸水之间有一条明显的水平的分界线，室温放置30min，勿动。期间配制浓缩胶。（3） 吸去双蒸水，用滤纸吸干，灌入浓缩胶，之后立即插入梳子，注意

36、保持水平，在浓缩胶凝固时经常补胶，待胶凝固时，水平拔出梳子。（4） 用双蒸水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中，动物轻柔。样品的准备7. 总体生存时间（Overall Survival, OS）：从手术当日到病人死亡之间的时间。无瘤生存率（disease-free survival DSF）：在接受手术和肿瘤复发或最后一次的随访之间的时间，肿瘤的病理分级按照TNM病理分级进行分类。1. 采用Transwell构建细胞共培养模型；具体实验分组及各组处理如下：组1：胃癌细胞单独培养组 完全培养基将胃癌细胞悬液调整密度为20×10*4cells/ml，将1ml以上密度的胃癌细胞悬液置于24孔板中

37、。共接3种，定期计数三培养孔中的细胞，计算细胞密度均值，绘制生长曲线。组2：纯化的外周血单核细胞单独培养组用1640完全培养基调整纯化的单核细胞密度为50×10*4cells/ml，将200l以上密度的细胞悬液加入24孔板中，加入RPMI-1640培养基至1ml体积。组3：单核细胞与胃癌细胞混合培养将细胞密度为50×10*4cells/ml纯化的单核细胞悬液200l加入Transwell嵌套内。将密度为20×10*4cells/ml的胃癌细胞悬液1ml加入24孔板中。将Transwell嵌套轻轻放置于24孔板之上开始共培养。由于外周血纯化的单核细胞数量有限，本组只

38、进行单孔培养，未设置副孔。将分组完毕的细胞放入37、CO2 5%的培养箱中培养，共培养96小时。2. 细胞处理及转染：细胞处理：将分离得到的细胞采用50ng/ml的IL4刺激，在37、5%CO2条件下培养0、6、12、24和48小时。这些细胞收集起来冻存在-80，而后用定量PCR方法检测miRNA的表达。1. 制备细胞悬液，加入75cm2培养瓶中，37、5%CO2温箱中孵育24h，培养箱中培养2h，吸取未贴壁细胞，1500r/min，离心5min，加入10cm玻璃皿中，然后向其加入含100ng/ml M-CSF的1640完全培养液，37含5%CO2培养箱内培养7d，收货贴壁细胞，细胞计数，调整

39、细胞密度为3×10*6/ml，加入六孔细胞培养板，分别加入100ng/ml M-CSF，40ng/ml IL-4和Transwell小室（4m，内铺单层胃癌细胞）建立M2-like，M2a和TAM三种M2表型巨噬细胞。2. 流失细胞术（1） 将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm、5min，弃上清（2） 以冷PBS1ml，离心洗涤，弃上清液（3） 加入PBS稀释的荧光素标记的抗体200l，用微量移液器轻轻吹打混匀，4或置冰上孵育30min-1h（4） 离心弃上清（5） 加入冷PBS 1ml，离心洗涤2次，以除去未结合的多余成分；（6） 向细胞中加入冷PBS 500l

40、，吹打混匀置流式管中，4避光保存，待测。正确的流式步骤：流式细胞术的荧光染色分析：（1） 收集细胞，用冷2%FCS的PBS洗涤细胞，并调整浓度为（15）×10*6/ml，反应体系为100l；（2） 直接加入适量的荧光素标记的抗体及同型对照抗体，混匀，4避光孵育2030min；（3） 离心弃上清，加入冷PBS离心洗涤一次，除去未结合的多余抗体成分；（4） 用2%多聚甲醛固定，4避光保存，待测。3. 不同细胞表型的诱导：MO型巨噬细胞的诱导：收集对数生长期THP-1细胞，调整细胞浓度为5×10*5个/ml，并按照2ml/孔接种于六孔板中，加入320nM的PMA处理24h即可诱导

41、得到未分化形态的巨噬细胞。M2型巨噬细胞的诱导：收集对数生长期THP1细胞，调整细胞浓度为5×10*5个/ml，并按照2ml/孔接种于六孔板中，加入320nM的PMA，6h后再加入终浓度为20ng/ml的IL-4处理18h，即可诱导得到M2型巨噬细胞。共培养条件下的巨噬细胞：收集对数生长期THP-1细胞，调整细胞浓度为5×10*5个/ml，并按2ml/孔接种于六孔板中，加入320nM的PMA，6h后与胃癌细胞进行非接触式共培养18h，诱导得到表型待定的巨噬细胞。3. M2型巨噬细胞与胃癌细胞的transwell非接触式共培养将2ml 1×10*5/ml胃癌细胞接种

42、于六孔板中，然后将1ml 1×10*6/ml的THP-1接种于共培养插件中，置于空的六孔板中培养，按照M2型巨噬细胞的诱导方法加入各种药物处理24h后，吸去插件中培养基，小心用PBS冲洗3次，再加入1ml新的含10%FBS的DMEM培养基；吸去培养胃癌细胞各孔的培养基，用PBS冲洗3次，再加入新的完全培养基；最后将装载有M2型巨噬细胞的插件一一对应放入培养胃癌新报的六孔板中，完成非接触共培养体系的装配。以不与M2共培养的胃癌细胞单独培养为对照。将体系放入恒温培养箱中培养，定期观察。4. 两种细胞（可以来自于同一种组织，也可来自不同组织）混合共培养，使其中一种细胞的形态和功能稳定表达，且维持较长时间，该技术能模拟体内微环境一方面。通过细胞与细胞之间的接触和作用，可引起胞质膜的直接接触并产生细胞外基质（ECM），ECM中含有由细胞分泌到细胞外间质中的分子物质，例如间质胶原、蛋白多糖及纤连蛋白等，构成了复杂的网架结构，遂模拟了与体内相似的微环境，支持并连接组织结构，调节组织发生及细胞的生理活动。直接共培养的细胞首先需要进行活体细胞染色，才能行分离提纯技术，便于进一步分子生物学检测。一般的生物材料是不能穿透细胞生物膜的，只有当细胞被固定，细胞膜被破坏后，染料才能进入细胞内部。但是，一些活细