黄瓜绿斑驳花叶病毒砧木种子发病观察及带毒检测

1、河南农业大学本科生毕业论文（设计） 题 目 黄瓜绿斑驳花叶病毒砧木种子发病观察及带毒检测 学 院 植物保护学院 专业班级 植物检疫（2）班 学生姓名 指导教师 撰写日期： 2014 年 5 月 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论文题目黄瓜绿斑驳花叶病毒砧木种子发病观察及带毒检测学位级别学士学生姓名学科专业植物检疫导师姓名学位论文是否保密否如需保密，解密时间 年 月 日独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书

2、而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。学生签名： 导师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河

3、南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有,否则，承担相应的法律责任。注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。学生签名： 导师签名： 学院领导签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 黄瓜绿斑驳花叶病毒砧木种子发病观察及带毒检测河南农业大学植物保护学院10级植物检疫专业2 班摘要：为了进一步了解黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV） 在砧木种子上的发病情况,加强对黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测，种植带有CGMM

4、V的砧木种子（葫芦种子），在苗期观察葫芦植株发病情况，并用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）检测。在长出2-5片真叶时，观察种植出苗的135株葫芦植株，出现显性症状的有5株，课题来源：中国农业科学郑州果树所DAS-ELISA检测全部为阳性，另外130株未发病。在每株未发病的植株上取1-2片真叶，进行DAS-ELISA检测，其中出现阳性（隐性带毒）的有6株，砧木种子植株隐性带毒率为4.62。结果表明：砧木种子植株可以隐性携带CGMMV，因此不能单从在苗期是否发病来判断植株是否携带该病毒。关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒；砧木种子；DAS-ELISA Cucumber green mottl

5、e mosaic virus infected rootstock seeds onset of observation and detectionPlant Protection College，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002, ChinaAbstract:To know more about the cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV) in the incidence of rootstock seeds strengthen the CGMMV detection and qua

6、rantine.Planting poisonous rootstock seeds(gourd seeds) ,observe the CGMMV in the incidence of gourd seedling plants and detected with Double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent method (DAS-ELISA).When the gourd plants grown 2-5 true leaves ,5 strains have dominance symptom and 130 strains

7、 have no dominance symptom in 135 strains of planting and coming out gourd plants.Taking 1 to 2 leaf in each having no dominance symptom strains ,6 strains result into positive ,detected by DAS-ELISA ,4.62% of not plant disease.The recessive poisoned of the seed of stock rate was 4.62%.It turns out

8、that the plant of the seed of stock can recessively bring CGMMV.So whether the plan carry CGMMV,can't judge only from whether the plan has dominance symptom in seedling stage. Keyword:CGMMV;poisoned seed;DAS-ELISA 1 引言 1935年Ainsworth在英国首次发现和报道黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)。随

9、着国际间日益广泛的运输业、旅游业等的发展以及日益频繁的引种，为该病毒的传播创造了空前的有利条件。该病毒对环境适应力极强、寄主广泛，一旦传入，很容易定殖。目前该病毒在英国、希腊、罗马尼亚、巴西、日本、伊朗、印度、韩国等及中国部分地区均有分布（兰香等，2007）。该病毒一旦在新环境中定殖，会对葫芦科植物的生长和发展造成严重威胁，因此，要严格控制该病毒的传播。2006年我国农业部(农业部公告第788号)将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物（周华众等，2009），严格控制该病毒的传入，保障葫芦科作物的正常生产。 黄瓜绿斑驳花叶病毒，作为烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的成员之一，能够侵染葫

10、芦科作物，严重威胁其生产（赵世恒等,2007）。该病毒的寄主主要是葫芦科植物，主要有黄瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、西葫芦、棱角丝瓜、无花果叶瓜、南瓜等。随着传播变异该病毒分化为多种株系，如西瓜株系、日本黄瓜株系、Yodo株系等。该病毒的不同株系在不同寄主、不同生长时期的危害症状不尽相同，但发病植株都出现叶片褪色形成不规则的淡绿色至黄色的斑点，呈花叶状，绿色部位突出表面，叶缘向上翻卷，叶片略微变细；严重时，呈黄绿色花叶症状，叶面凹凸不平，叶片明显硬化等相同的症状（周华众等，2009），可以作为判断黄瓜绿斑驳花叶病毒病的一种指标。 该病毒主要借助种子带毒、土壤传染等远距离传播，据研究感染CGMMV西瓜、

11、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主（赵世恒等,2007）。另外，农事操作、嫁接等也容易造成CGMMV的接触性传染，研究发现接触到病株汁液的健康植株可在712d内发病（吴会杰等，2011）。此外，在田间CGMMV还可以通过介体传毒，寄生性植物菟丝子就是其中之一；另外，黄瓜叶甲很可能是该病毒的昆虫传播介体。桃蚜和棉蚜不能传播该病毒；被侵染葫芦、瓠子的根际土壤中未发现介体真菌（张永江，2006）。黄瓜绿斑驳花叶病毒是单链RNA病毒，病毒粒子为直型棒状，具有很强的抗原性，与其它烟草花叶病毒属出现的症状在形态学上很相似，在血清学上也很相关。西瓜株系与英国的两个株系及印

12、度的C株系有较近的亲缘关系，但与日本的黄瓜株系、Yodo株系及烟草花叶病毒却有较远的亲缘关系，而与番茄花叶病毒及烟草花叶病毒属的其他成员的亲缘关系更远(Nozu et al,1971)。日本黄瓜株系与Yodo株系的亲缘关系很近。所有株系都是极端稳定的，典型株系90处理10min失去侵染能力，在常温下该病毒侵染力可保持数月之久，在0环境下可保持数年（Daryono B S et al,2002）。关于对CGMMV的防治，目前主要是通过加强检疫防控，提高检疫意识，做好疫情监测和调查该病毒的传播。此外，种子处理，土壤处理，加强田间管理也是常用的防治方法（苗超等，2013）。检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方

13、法主要有：生物学鉴定法、血清学检测法、分子生物学等（赵世恒等,2007）。相比较而言，血清学检测方法是一种用于常规检测的有效方法，具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，目前应用最多的血清学检测法是酶联免疫吸附法（罗梅等，2010）。2 材料与方法2.1 供试材料 检测用的砧木种子是感染黄瓜绿斑驳花叶病毒并表现明显症状的葫芦植株留下的种子，阳性对照为本实验室分离纯化接种保存在葫芦上的黄瓜绿斑驳花叶病毒，阴性对照为健康葫芦植株收取的种子。2.2 种子带毒检测分别从健康的和感染病毒的葫芦种子中随机抽取30粒种子，用适量的磷酸盐缓冲液(0.1mol/l，pH74)浸泡3-5h。用0.1mol/l磷酸

14、缓冲液（pH74）稀释1000倍，通过DAS-ELISA试验检测种子带毒情况，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。（DAS-ELISA试验方法参考2.3.3.2）2.3 苗期症状观察与鉴定2.3.1 种子处理分别取50粒健康的、200粒感染病毒的砧木种子（葫芦种子），由于葫芦果实属于瓠果类，种子有一坚硬外壳，出芽时间较长，在种子尖端开一小口，常温水浸泡于消过毒的烧杯中。3-5h后，将浸泡过的种子包于湿润的纱布中，放于28的温箱中培育，培育期间要保持纱布湿润。长出短芽（不能过长，防治断芽）后取出，并播种于装有机质土（没有种植过植物，确保土壤中没有CGMMV或症状不容易与CGMMV症状区分的病害

15、或毁灭性病害）的浅盘中放于人工气候箱中培养，光照时温度设置为28、湿度设置为为70RH，每天培养16h；黑暗处理时，温度设置为24、湿度设置为70RH，每天培养8h。2.3.2 症状观察 等到种植的砧木种子长出两片真叶时，将成活的135株植株标记为：植株1、植株2、植株3植株133、植株134、植株135。连续观察10天以上，并与健康植株对照。记录出现CGMMV明显症状的植株，并采集发病叶片。每采集一株发病植株的真叶时都要换一次性聚氯乙烯手套，防止接触传毒造成的误差。及时清除坏死植株，保持培养环境的清洁，避免交叉感染。2.3.3 双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测2.3.3.1

16、 缓冲溶液和样品的制备 1. 抗体包被缓冲液（0.05mol/L pH9.6的碳酸盐溶液）的配制：Na2CO3 1.6g、NaHCO3 2.94g、NaN3 0.2ml ,无菌水定容至1L。 2. 洗涤缓冲液（pH7.4 的PBST溶液）的配制：NaCl 8.0g、 NaHCO3·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g、KCl 0.2g、适量的Tween20,无菌水定容至1L。 3. 抗体稀释缓冲液的配制：20g PVP溶于1LPBST溶液中。 4. 底物缓冲液（pH9.8)的配制：二乙醇胺10ml、蒸馏水80ml，用 浓HCl将溶液的pH调制9.8，蒸馏水定容至100ml。

17、5. 样品的制备：新鲜叶片按1：5比例、干燥的叶片按1:10的比例用抗体稀释缓冲液研磨，离心，4冰箱保存。2.3.3.2 DAS-ELISA反应 1. 包被酶联板与抗体吸附：CGMMV抗血清、酶标抗体等购自美国Agdia公司，按照1:2000的比例用抗体包被缓冲液稀释抗体。除空白对照每孔加入100ul ddH2O之外,每孔加入100ul稀释抗体。保鲜膜密封后，放于4冰箱中静置过夜。 2. 抗原抗体的结合：甩尽酶联板上的抗体溶液，用洗涤缓冲液洗板三次，每次都要在吸水纸上拍尽孔内的溶液，每次洗板3min；除空白对照每孔加入100ul抗体稀释缓冲液外，每个样孔加入100ul样品，一个样品两个重复，同

18、时设置阳性和阴性对照。放置于4冰箱中培育过夜。 3. 加入酶标抗体和底物：洗板（同上）；按1:2000的比例用稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加入100ul，28温箱中温育3h；洗板（同上）；用底物缓冲液将底物（对硝基苯磷酸二钠）稀释至1mg/ml,每孔加入100ul，遮光放入28的摇床中，每隔30min观察一次，并记录出现阳性的样品。2.3.3.3 读数及数据分析 待阳性对照孔呈一定程度的黄色时，用安托斯全自动酶标仪(Anthos 2010)读取在405nm 处的吸光值，根据公式：I/H=（样品的平均吸光值-空白对照平均吸光值）/（阴性对照的平均吸光值-空白对照平均吸光值）计算并判断检测结果。若

19、I/H3，则检测样品为阳性；若I/H3，则检测样品样品为阴性。2.4 砧木种子植株隐性带毒检测将种植出苗的的135株植株中的130株未发病的植株分为26组，5株植株为一组。在每株植株的叶片上取适量的叶样，混合放入消毒的研钵中，并加入1-2ml的0.1mol/l磷酸盐缓冲液(pH74)，充分研磨，直到样品成液体状为止；将研磨好的待测样品转移到2ml消毒的离心管中；离心；放入4冰箱中保存。DAS-ELISA反应检测样品（DAS-ELISA方法同2.3.3.2）。然后，对DAS-ELISA检测为阳性的组中的每一株进行检测。再对检测结果为阳性的植株独立观察一周左右，观察该植株是否出现CGNNV发病症状

20、。3 结果与分析3.1 种子带毒检测 表1：种子带毒情况检测结果测定样品DAS-ELISA检测结果酶标仪测定结果感染病毒植株的种子+3.2613.543健康植株的种子0.6680.284阳性对照+3.5663.547阴性对照0.5230.323空白对照0.2680.284注：“+”表示检测结果为阳性；“”表示检测结果为隐性 由表1可见，随机抽检的30粒感染黄瓜绿斑驳花叶病毒明显表现出CGMMV症状的葫芦植株留的种子（感病种子）与CGMMV抗血清反应I/H=8.043，呈阳性，表明随机抽取的30粒种子携带有CGMMV；健康葫芦植株的种子（健康种子）与CGMMV抗血清反应I/H=1.125，呈阴性

21、，表明随机抽取的30粒种子中不携带CGMMV，可以作阴性对照。3.2 苗期症状观察与检测种植出苗的健康的葫芦种子39株植株中没有出现发病植株，发病率为零；以此为对照，种植出苗的135株感病葫芦种子中，有5株出现明显的CGMMV侵染症状。DAS-ELISA检测发病植株，5株发病植株检测结果均呈阳性酶标仪读数计算结果I/H值均大于3（表2）。表2：发病植株带毒情况检测结果检测样品酶标仪测定结果DAS-ELISA检测结果I/H值植株1 3.43.401+3.840203275植株2 2.3253.326+3.190852626植株3 3.3362.564+3.331451158植株4 3.4693.

22、034+3.671936759植株5 3.1283.129+3.533032185空白对照0.6730.456-0.637492942阳性对照3.4563.334+3.833992095隐性对照1.0960.675-1注：“+”表示检测结果为阳性；“”表示检测结果为隐性。 由表2可见，健康的葫芦种子不带毒，也没有受到CGMMV侵染，没有出现明显的CGMMV发病症状，可以作为阴性对照；感病植株的种子带毒，CGMMV可借助种子传播，而且发病种子植株能表现出明显的CGMMV发病症状。但是种子传毒的发病率较低，这可能还与其它原因有关，有待进一步研究。3.3 未发病植株的带毒检测 经过DAS-ELISA

23、检测，在26组未发病的植株中有4组双抗夹心酶联免疫反应结果呈阳性，说明有阴性带毒的植株（表3，见下页）。表3：无CGMMV发病症状组检测结果组别酶标仪测定结果DAS-ELISA检测结果I/H值组11.0340.986-2.362573099组20.6780.786-1.712280702组31.3320.504-2.147368421组43.53.5+8.187134503组50.8950.765-1.941520468组61.0120.994-2.34619883组71.0531.045-2.45380117组80.2140.133-0.405847953组91.1581.124-2.669

24、005848组101.0340.675-1.998830409组111.3250.436-2.059649123组121.2311.132-2.76374269组133.53.5+8.187134503组141.3461.046-2.797660819组150.7620.689-1.697076023组160.8711.543-2.823391813组171.2110.936-2.511111111组180.8710.754-1.900584795组191.0341.046-2.432748538组203.2313.345+7.69122807组210.9570.764-2.012865497

25、组220.8320.857-1.975438596组230.3420.344-0.802339181组243.53.5+8.187134503组250.2330.564-0.932163743组260.4640.564-1.202339181空白对照0.1540.256-0.479532164阴性对照0.5340.321-1阳性对照3.4533.152+7.725146199注：“+”表示检测结果为阳性；“”表示检测结果为隐性。对双抗夹心酶联免疫反应呈阳性的4组中的20株植株进行双抗夹心酶联免疫反应检测，其中有6株反应呈阳性，酶标仪检测计算结果大于3（表4）。表4：检测结果为阳性各组植株检测结

26、果组别植株酶标仪测定结果DAS-ELISA检测结果I/H值组4植株220.09340.986-1.352123262植株232.6782.786+6.844544657植株240.6320.594-1.535763497植株263.53.5+8.768633346植株270.8950.765-2.079418765组13植株640.8120.913-2.160841789植株650.6530.645-1.625955155植株663.53.5+8.768633346植株670.5460.657-1.506952274植株691.1340.975-2.641863961组20植株1003.425

27、2.936+7.968182388植株1020.2310.932-1.456845797植株1033.53.5+8.768633346植株1040.8460.946-2.244770137植株1050.6620.789-1.817612426组24植株1210.9711.043-2.52286108植株1220.8110.936-2.188400351植株1230.6710.854-1.910309407植株1242.9342.646+6.989853439植株1250.8311.045-2.349993737对照空白对照0.2320.304-0.671426782阴性对照0.44430.35

28、4-1阳性对照2.5323.5+7.55605662注：“+”表示检测结果为阳性； “”表示检测结果为隐性。 由表4可见，即使没有出现明显CGMMV发病症状的寄主植株也有可能携带CGMMV，即砧木种子植株可以隐性带毒，此次试验135株植株中隐性带毒率为4.62。所以，在检验检疫CGMMV时不能仅仅从葫芦植株发病与否来判断植株是否带毒，必须根据血清学或生物学等原理进一步确定。4 结论与讨论随机抽取的30粒感病植株的种子，DAS-ELISA试验检测结果呈阳性，说明CGMMV可以通过种子带毒传播；播种出苗的135株植株中有5株出现明显的CGMMV发病症状；130株未出现明显症状的植株通过DAS-EL

29、ISA试验检测，检测结果有6株植株出现阳性，即有6株植株隐性带毒，检测到的隐性带毒率为4.62。所以，可以确定黄瓜绿斑驳花叶病毒在带毒砧木种子植株上可能即可以出现明显的CGMMV发病症状（即显性带毒），也可以不出现明显的CGMMV发病症状的带毒现象（即隐性带毒）。 带毒砧木种子在苗期是否发病与砧木种子的带毒率与传毒率有很大的关系。虽然至今尚未明确CGMMV的田间传毒媒介，但是一旦在田间出现因种子带毒发生的病苗，即使是很低的比例，也会以此为初侵染源，通过非介体因素传播，引起病害流行，从而造成严重损失，也可能是本实验误差来源之一。本实验组检测到CGMMV的葫芦种子传毒率0.92%，带毒率是100%

30、。然而，Choi Gug Seounf 检测感染CGMMV的葫芦种子带毒率为84,传毒率为2（Choi Gug Seoun，2001）；秦碧霞等检测感染CGMMV的葫芦种子带毒率为100，传毒率为1.01（秦碧霞等，2011）。说明不同批次的同品种种子带毒率和传毒率也不同，所以随机取样和抽取足量样本进行检测更能真实反映种子的带毒情况。另外，由于种子传毒与否及种传率高低除与病毒本身有关外，还受植株品种、感染时期，环境条件及各种园素互作影响（季良，1995）造成试验误差。检测种子数量较少、观察时间不够长实验结果也可能造成一些误差。 除了种子传毒对病害的流行传播有重要影响以外，该病毒也极易通过汁液摩

31、擦、叶片接触、嫁接、农事操作等非介体传播（张永江，2006）造成误差。另外，DAS-ELISA检测误差，也是造成误差的主要来源。此外，葫芦是我国很多西瓜产区用于嫁接防治枯萎病的主要砧木，葫芦种子带毒很容易通过嫁接传染接穗西瓜苗，从而扩散到大田引起严重的后果（赵红运等，2006）。 黄瓜绿斑驳花叶病毒是我国农业植物检疫性有害生物和进境检疫性有害生物，由于该病毒极强的稳定性、具有广泛的适宜寄主和多种传播特性，在我国定殖和扩散的风险性极高(元华等，2010)。建立完善的葫芦科种子检验检疫规程制度和加强检疫监管是防止该病毒传播危害的主要手段。此外，对商品用种和引进调运的种子进行消毒处理，加强抗病品种培

32、育等多途径手段综合应用，阻断该病毒的传入、定殖及扩散，从而促进葫芦科作物生产持续、稳定、健康发展。 种子携带病毒是该病毒远距离传播的主要形式，种子带毒灭活处理也已经有很多成功的方法(Kim Sang-Min et al , 2003) 。本实验研究表明，带有该病毒的砧木种子植株有隐性带毒的可能，所以不能单从是否出现明显发病症状判断该苗木是否带有该病毒。目前，DAS-ELISA和反转录PCR（RT-PCR）等方法已经成功应用于快速灵敏检测种子携带的CGMMV（Kim Du-Hyun et al -1999）。所以，加强CGMMV的检验检疫不应单从观察症状有无来判定，必须建立和发展以血清学和生物学

33、等原理为基础的准确、快速、简便的测定方法。参考文献1.兰香，谢丙炎，杨宇红等检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测和防疫控制中国蔬菜，2007(9)：3438.2.季良植物种传病毒与检疫M北京：中国农业出版社，1995：129.3.罗梅，王琳，宾淑英等.黄瓜绿斑驳花叶病毒检测技术的研究进展.华中农业大学学报.2010,29(3):392-396.4.苗超，黄广飞.黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生及危害防控措施.安徽农学通报.2013,19(08).5.秦碧霞，蔡健和，陆秀红等.葫芦种子传黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测.植物保护.2011.37(3):109-112.6.吴会杰，秦碧霞，陈红运等.黄瓜绿斑驳花叶病毒

34、西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率.中国农业科学.2011,44（7).7.元华，李立梅，赵秀香等黄瓜绿斑驳花叶病毒在我国定殖和扩散的风险性分析J植物保护，2010，36(1)：3336.8.周华众，向子钧，匡辉.黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生特点及综合控制技术.湖北植保，2009年（4）：52.9.赵世恒,李明福,张永江等.引进种质西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测J.北京农科院学报,2007,22(2):32-34.10.赵红运，赵文军，程毅等辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定J植物病理学报，2006，36(4)：30630911.张永江.黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展.河南农业大学报.2006年（08）：

35、05-09.12.Choi GugSeoun Occurrence of two Tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in KoreaJ.Plant Pathology Journal.2001，17(5)：24324813.Daryono B S，Natsuaki K T，Nishimura SApplication of random amplified polymorphic DNA markers for detection of resistant cultivars of melon (Cucumis melo)against Cucurbitaceae virusesJActa Horticulturae，2002，588：321329.14.Kim Du-Hyun Lee Jung-Myung，Bae Jin-Ju 235 See