发酵染菌及其控制PPT精品文档

1、1主讲：鲍成满第十章第十章 发酵发酵染菌及染菌及其其防治防治2知识目标知识目标l掌握染菌对发酵过程的影响；掌握染菌对发酵过程的影响；l掌握发酵异常现象及原因分析掌握发酵异常现象及原因分析l掌握杂菌污染的途径掌握杂菌污染的途径能力目标：能力目标：l能够发现种子培养和发酵的异常现象；能够发现种子培养和发酵的异常现象；l能进行染菌的检查和判断、发酵染菌原因能进行染菌的检查和判断、发酵染菌原因分析；分析；l能杂菌污染的挽救与处理措施。能杂菌污染的挽救与处理措施。3第一节第一节 染菌对发酵的影响染菌对发酵的影响第二节第二节 发酵染菌的分析发酵染菌的分析第三节第三节 杂菌污染的途径和防止染菌杂菌污染的途径

2、和防止染菌4第一节第一节 染菌对发酵的影响染菌对发酵的影响 纯种培养要求必须防止杂菌污染，为防纯种培养要求必须防止杂菌污染，为防止染菌，采取措施：止染菌，采取措施：密闭式发酵罐、无密闭式发酵罐、无 菌空气、无菌室、培养菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作基和设备灭菌、无菌操作 5染菌率的统计染菌率的统计 以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消的重复染菌批批（次）应包括染菌重消的重复染菌批（次）在内。整个发酵周期中，无论前期（次）在内。整个发酵周期中，无论前期或后期染菌，均作或后期染菌，均作“染菌染菌”论处。论处。发酵（罐）染菌批（次）发

3、酵（罐）染菌批（次）总投罐批（次）总投罐批（次）染菌率（染菌率（%） = = 100% 100% 6一一 染菌对染菌对不同不同发酵发酵过程过程的影响的影响 青霉素发酵：发酵前、中、后期都很容易青霉素发酵：发酵前、中、后期都很容易感染能产青霉素酶的杂菌，能使青霉素迅速感染能产青霉素酶的杂菌，能使青霉素迅速破坏，使发酵一无所获。破坏，使发酵一无所获。7柠檬酸发酵：产酸后，发酵液柠檬酸发酵：产酸后，发酵液pHpH很低，很低，不易染菌，主要防止前期染菌。但对于不易染菌，主要防止前期染菌。但对于能在较低能在较低pHpH发酵液中生长的杂菌来讲，发酵液中生长的杂菌来讲，其对柠檬素发酵危害也很大，如青霉菌。其

4、对柠檬素发酵危害也很大，如青霉菌。8谷氨酸发酵：周期短，产酸快，培养谷氨酸发酵：周期短，产酸快，培养基不太丰富，不易染菌，主要防噬菌体。基不太丰富，不易染菌，主要防噬菌体。一旦受到噬菌体污染，其蔓延迅速，难一旦受到噬菌体污染，其蔓延迅速，难以防治，而且容易造成连续污染。以防治，而且容易造成连续污染。9 疫苗发酵：现在疫苗多采用深层培养，疫苗发酵：现在疫苗多采用深层培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品，这是一类不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。废弃。10 肌苷、

5、肌苷酸发酵：生产菌为多种营肌苷、肌苷酸发酵：生产菌为多种营养缺陷型，生产能力差，培养基营养丰养缺陷型，生产能力差，培养基营养丰富，易受到各种生长较快的杂菌污染，富，易受到各种生长较快的杂菌污染，如芽孢杆菌，而且染菌后培养基中营养如芽孢杆菌，而且染菌后培养基中营养成分迅速消耗，严重抑制生长菌生长和成分迅速消耗，严重抑制生长菌生长和产物的生成。产物的生成。11二二 不同不同时间发生时间发生染菌对发酵的影响染菌对发酵的影响 种子培养期染菌：培养基营养丰富，容易种子培养期染菌：培养基营养丰富，容易染菌，而且种子染菌对发酵危害较大，应严染菌，而且种子染菌对发酵危害较大，应严格控制种子污染。格控制种子污染

6、。12发酵前期染菌：较容易染菌，污染后杂菌发酵前期染菌：较容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧，严迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧，严重抑制生产菌的生长繁殖，最终导致产物的重抑制生产菌的生长繁殖，最终导致产物的积累大大减少，甚至造成发酵失败。积累大大减少，甚至造成发酵失败。13发酵中期染菌：发酵中期染菌： 危害极大，不但影响生产菌的继续生长，危害极大，不但影响生产菌的继续生长，还会严重干扰生产菌的产物合成代谢，减少还会严重干扰生产菌的产物合成代谢，减少产物的生成。而且由于营养成分大量消耗，产物的生成。而且由于营养成分大量消耗，发酵产物正在大量积累，一般挽救处理困难，发酵产物

7、正在大量积累，一般挽救处理困难，危害性很大。故在实际生产中应做到早发现危害性很大。故在实际生产中应做到早发现快处理。快处理。14发酵后期染菌：发酵后期染菌： 发酵后期产物积累较多，营养接近耗尽，发酵后期产物积累较多，营养接近耗尽，此时染菌影响相对小些，一般可继续发酵；此时染菌影响相对小些，一般可继续发酵；若污染严重，可采取提前放罐来减少损失。若污染严重，可采取提前放罐来减少损失。15三三 染菌程度对发酵的影响染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大数目越多，对发酵的危害越大 染少量杂菌，有时可以容忍。染少量杂菌，有时可以容

8、忍。 16四四 染菌对产物提取和产品质量的影响染菌对产物提取和产品质量的影响 菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难困难17第第二二节节 发酵染菌的分析发酵染菌的分析一一 发酵发酵染菌的染菌的异常现象异常现象 指由于发酵染菌导致发酵过程中某些物理参指由于发酵染菌导致发酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发生于原有规律不同数、化学参数或生物参数发生于原有规律不同的改变。的改变。1 1 种子培养染菌后的异常现象种子培养染菌后的异常现象1. 1.2 2 发酵染菌后的异常现象发酵染菌后的异常现象181 1 种子培养染菌后的异常现象种子培养染菌后的异常现象 菌体浓度异常

9、：包括菌体浓度逐渐降菌体浓度异常：包括菌体浓度逐渐降低和菌体浓度迅速升高低和菌体浓度迅速升高 理化指标异常：杂菌生长则导致宏观理化指标异常：杂菌生长则导致宏观理化指标发生变化，如温度、理化指标发生变化，如温度、pHpH值等值等 代谢异常：碳源、氮源消耗速度发生代谢异常：碳源、氮源消耗速度发生变化。变化。192 2 发酵染菌后的异常现象发酵染菌后的异常现象 菌体浓度异常：发酵中菌体或菌丝浓菌体浓度异常：发酵中菌体或菌丝浓度是固有规律在变化度是固有规律在变化 pHpH值过高或过低：值过高或过低：pHpH值变化是所有值变化是所有代谢的综合反映，固定发酵阶段代谢的综合反映，固定发酵阶段pHpH值值具有

10、一定规律具有一定规律20 溶解氧和二氧化碳水平异常：可以断溶解氧和二氧化碳水平异常：可以断定是发生染菌现象定是发生染菌现象21 泡沫过多：污染噬菌体非常容易产生泡沫过多：污染噬菌体非常容易产生过多泡沫过多泡沫22 代谢异常：营养物质的利用和产物的代谢异常：营养物质的利用和产物的生成出现异常现象。生成出现异常现象。23二二 染菌的检查与判断染菌的检查与判断1. 1.染菌的检查染菌的检查 显微镜检查法（最简单、最直接、最显微镜检查法（最简单、最直接、最经常）经常） 平板划线培养或斜面培养检查法；平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温平板制好后，应先保温2424小时，确定无小时，确定无

11、菌菌24 肉汤培养基检查法（酚红变色肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-pH6.8-8.48.4） 双层平板培养法检查双层平板培养法检查25262.2.检查法的不足检查法的不足 以上以上3 3种检查法未发现染菌，还不能种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌肯定未被染菌 原因是以上检查法只能检查杂菌浓度原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（较大的染菌情况（11个个/ml/ml）27三三 染菌原因的分析染菌原因的分析 造成发酵染菌的原因有很多，归纳起来造成发酵染菌的原因有很多，归纳起来有：种子带菌、无菌空气带菌、设备渗漏、有：种子带菌、无菌空气带菌、设备渗漏、原辅料灭菌不彻底、操作失误

12、和技术管理原辅料灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。不善。28 项目项目 百分率百分率%总空气系统有菌总空气系统有菌 19.96种子带菌或怀疑种子带菌种子带菌或怀疑种子带菌 9.64夹套穿孔夹套穿孔 12.36盘管穿孔盘管穿孔 5.89接种管穿孔接种管穿孔 0.39阀门渗漏阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏罐盖漏 1.54其它设备渗漏其它设备渗漏 10.13操作原因操作原因 10.15接种时罐压跌零接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透培养基灭菌不透 0.79泡沫冒顶泡沫冒顶 0.48原因不明原因不明 24.94几几家家抗抗生生素素工工厂厂发发酵酵染染菌菌原原因因

13、返回29 项目项目 百分率百分率%管理不善管理不善 25. 08阀门渗漏阀门渗漏 23.30盘管穿孔盘管穿孔 14.20种子带菌种子带菌 14.15空气系统有菌空气系统有菌 10.0其它其它 7.49原因不明原因不明 5.78 上海第三制药厂染菌原因分析上海第三制药厂染菌原因分析 返回30 管理不善而染菌的有管理不善而染菌的有31个罐批，占个罐批，占25.08。经分析有下列原因：经分析有下列原因： 项目项目 百分率百分率%进罐前未做设备严密度检查进罐前未做设备严密度检查 25.8接种违反操作规程接种违反操作规程 25.8检修质量缺乏验收制度检修质量缺乏验收制度 19.35操作不熟练操作不熟练

14、19.35配料违反工艺规程配料违反工艺规程 6.45调度不当调度不当 3.2531上海第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析上海第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%空气系统有菌空气系统有菌 26.00接种接种 11.00管理问题管理问题 7.80外界带入杂菌（取样、补料）外界带入杂菌（取样、补料） 8.20设备穿孔设备穿孔 7.60停电罐压跌零停电罐压跌零 1.60蒸汽压力不足或蒸汽量不足蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60操作违反规程操作违反规程 1.60种子带菌种子带菌 0.60原因不明原因不明 35.0032 一般染菌原因分析一般染菌原因分析 不同染菌时间分析不同染菌时间分

15、析 不同染菌类型分析不同染菌类型分析 不同染菌幅度分析不同染菌幅度分析33（1 1）染菌的时间分析）染菌的时间分析种子培养阶段：种子，灭菌，操作；种子培养阶段：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵前期：种子，灭菌，操作；发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫34（2 2）染菌的杂菌种类分析：）染菌的杂菌种类分析：杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角）杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等）备渗漏，管理操作等）杂菌是真菌杂菌是真菌35（3 3）染菌的规模分析）染菌

16、的规模分析大批量发酵罐染菌：种子、空气；大批量发酵罐染菌：种子、空气； 前期：种子带菌，灭菌问题；前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；中后期：空气带菌；部分发酵罐染菌：部分发酵罐染菌：个别发酵罐连续染菌：设备渗漏个别发酵罐连续染菌：设备渗漏36第三节第三节 杂菌污染的途径和防止染菌杂菌污染的途径和防止染菌种子带菌及防治种子带菌及防治空气带菌及防治空气带菌及防治培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治操作失误和设备渗漏导致的染菌及防治操作失误和设备渗漏导致的染菌及防治噬菌体污染及防治噬菌体污染及防治染菌的挽救与处理染菌的挽救与处理371 1、种子带菌的防

17、治、种子带菌的防治 菌种在培养或保存过程中受污染（试菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意）管塞，查看的时候要注意） 培养基及用具灭菌要彻底，应防止假培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压压 菌种在转接过程中受污染：操作不当，菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间）管理不严；（缓冲间）382 2、无菌空气带菌及其防止：、无菌空气带菌及其防止： 流程设计，介质灭菌流程设计，介质灭菌393 3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治 原料性状：淀粉质原料，升温过快或原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的混合不均

18、匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶粉酶 实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。放气。40 连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底 设备和管道存在设备和管道存在“死角死角” 死角：由于操作、设备结构、安装死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应不能有效到达或不能充分到达预

19、定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。到彻底灭菌的要求。41常见的设备、管道常见的设备、管道“死角死角” 发酵罐的发酵罐的“死角死角”：不锈钢衬里破裂造成死：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。角，发酵罐罐底脓疱状积垢。4243444 4、设备渗漏引起的染菌及其防止、设备渗漏引起的染菌及其防止 发酵设备、管道、阀门长期使用，由发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏漏 微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞湿酚酞 指示剂的白布擦，有渗漏则指示剂的白

20、布擦，有渗漏则白布显红色。白布显红色。455 5、操作失误导致染菌及其防治、操作失误导致染菌及其防治 灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生加消泡剂防止泡沫大量产生 传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。能导致灭菌不彻底。46 灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生加消泡剂防止泡沫大量产生 传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。能导致灭菌不彻底。476 6、噬菌体污染和防治、噬菌体污染和防治 48（1 1）噬菌体污染的预防）噬菌体污染的预防 严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内 抑制罐内噬菌体的生长抑制罐内噬菌体的生长49（2 2）污染噬菌体后的处理方法）污染噬菌体后