培养基主成分优化提高大花金挖耳胞内黄酮产量

1、培养基主成分优化提高大花金挖耳胞内黄酮产量摘要：【目的】优化组合培养基中大量、微量元素及附加激素等培养条件，筛选出大花金挖耳细胞培养黄酮的生产培养基。【方法】以NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA为根本培养基，先优化组合其大量元素NH+4、NO-3、K+，再优化组合微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+，最后分别附加2，4-D、KT、GA3，测定大花金挖耳悬浮培养细胞生长、黄酮含量及产量。【结果】大量元素优化、微量元素优化及附加激素KT、GA3，大花金挖耳细胞培养物中黄酮产量均得到了显著提升P关键词：大量元素;微

2、量元素;植物激素;黄酮;大花金挖耳中图分类号：Q813.1文献标识码：A文章编号：1008-0384202106-652-08Abstract：【Objective】FormulationofthemediumforCarpesiummacrocephalumculturetoproduceflavonoidswasoptimizedfromtheoneobtainedbyapreviousstudy.【Method】UsingNT+NAA1.0mg·L-1+0.2mg·L-16-BAasthebase，themediumoptimizationswerefirstlyca

3、rriedoutonthemacro-elements，NH+4，NO-3andK+，thenthemicro-elements，MoO2-4，Zn2+，BO3-3，Co2+，Cu2+，I-，andMn2+andfollowedbytheadded2，4-D，KTandGA3.Thecellulargrowthaswellastheflavonoidsyieldintheculturesuspensionweremonitoredforevaluation.【Result】Withtheoptimizedadditionofthemacro-andmicro-elementsplusKTorG

4、A3，theflavonoidsproducedbyC.macrocephalumculturesignificantlyincreasedPKeywords：macroelements;microelements;phytohormone;flavonoids;Carpesiummacrocephalum0引言【研究意義】大花金挖耳CarpesiummacrocephalumFranch.etSav.系菊科天名精属多年生草本植物，具有抗肿瘤、止血等医用价值1-2和杀菌、杀虫及除草等农药活性3-5。黄酮类化合物是其主要活性成分之一6-7，具有抗菌、抗病毒、抗癌等药用价值和病虫害防御、化感等植保

5、作用8-9，具有极大的开发价值。【前人研究进展】利用细胞培养生产黄酮类化合物是解决大花金挖耳野生植物资源短缺和黄酮类化合物人工合成困难等问题的有效手段10-11。培养基种类、大量元素、微量元素、植物激素、诱导子、细胞系、光照、pH等因素都会对植物细胞生物合成黄酮类化合物产生影响12。郭佳祺13通过优化接种量、培养基、转速、pH值、无机盐浓度、光照周期等培养条件，提高了蒺藜细胞生物合成黄酮的能力;赵德修等14开展了温度、光照、激素、碳源等不同理化因子对雪莲培养细胞生物合成黄酮的研究;陈红贤等15研究发现碳源、氮源、磷源等大量元素的消耗与国槐槐角种胚细胞生长和黄酮的积累密切相关，黄酮的积累和细胞生

6、长属于局部生长偶联型。李玉平等11，16-17研究了大花金挖耳愈伤组织的诱导、增殖，建立了细胞悬浮系，并初步开展了培养基、大量元素、微量元素等理化因素对大花金挖耳细胞培养黄酮类化合物的研究。【本研究切入点】在前期研究中，采取单因素试验已筛选出了对大花金挖耳细胞培养生产黄酮类化合物有显著影响的大量元素17和微量元素18中各元素的最适浓度，亟待进一步优化组合相关理化因子及培养条件，提高大花金挖耳培养细胞的黄酮产量。【拟解决的关键问题】本研究遴选对大花金挖耳培养细胞生长和黄酮含量增加有奉献的硝酸钾KNO3、硝酸铵NH4NO3、钼酸钠Na2MoO4·2H2O、硫酸锌ZnSO4·7H

7、2O、硫酸铜CuSO4·5H2O硼酸H3BO3等大量、微量元素化合物进行组合优化，并分别附加激素2，4-D、KT、GA3，旨在筛选黄酮生产培养基，提高细胞黄酮产量，为大花金挖耳工厂化细胞培养黄酮类化合物提供依据。1材料和方法1.1试验材料1.1.1细胞悬浮系大花金挖耳细胞悬浮系由西北农林科技大学陕西省生物农药工程技术研究中心筛选获得16，繼代培养于根本培养基NT0NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA+40g·L-1蔗糖。继代培养时间为710d细胞生长的对数期，培养条件：pH5.8、摇床120r·min-1、25±

8、2，光照强度15002000lx、光照12h·d-1，下同。1.1.2仪器和试剂主要仪器：EBP-190S电子天平Sartorius公司;S-315TomyHigh-pressuresteamsterilizerTomyKOGYOCO.LTD.NerimaTokyo.Japan;UV1102紫外/可见分光光度计上海天美科学仪器;PHS-25型酸度计上海雷磁仪器厂;ZRD-5030全自动鼓风枯燥箱上海智诚分析仪器制造;HZT2双层振荡器哈尔滨市东联电子技术开发。主要试剂：芦丁标准品中国药品生物制品检定所;萘乙酸NAA、6-苄氨基嘌呤6-BA、二氯苯氧乙酸2，4-D、苄氨基腺嘌呤KT、赤

9、霉酸GA3美国Sigma公司;培养基中添加的蔗糖、肌醇及NT19培养基中添加的各种化合物均为分析纯;丙酮为分析纯。1.2试验方法1.2.1悬浮培养细胞生长及黄酮累积的优化试验将根本培养基NT0中培养710d的细胞接种40g·L-1鲜重于试验所设计的培养基中，试验均采用250mL三角瓶，每瓶100mL液体培养基。培养条件同上。考察大量、微量元素优化及附加激素2，4-D、KT、GA3对悬浮培养细胞生长及黄酮累积的影响。向培养基NT0中添加KNO3和NH4NO3，对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮含量增加有显著影响的大量元素NH+4、NO-3、K+进行优化组合表1，其他大量元素为NT培养基

10、固有浓度19，以NT0为对照CK，考察大量元素优化组合对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响，并得到生产培养基NT1;在大量元素优化组合的根底上，选取前期试验中对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮含量增加最为显著的MoO2-4、Zn2+两种微量元素进行优化组合表2，BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素离子浓度依次为：0.4mmol·L-1、0.2mol·L-1、0.4mol·L-1、10mol·L-1、0.2mmol·L-1，以NT1为对照CK，考察微量元素优化组合对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响，并得到生产

11、培养基NT2;在大量元素和微量元素优化组合培养基的根底上，以NT2为对照CK，再分别添加2，4-D0、0.1、0.2、0.5、1.0mg·L-1、KT0、0.1、0.2、0.5、1.0mg·L-1和GA30、0.1、0.2、0.3、0.5mg·L-1，进一步研究激素对细胞生长和黄酮产量的影响。1.2.2生物量的测定将上述不同试验处理培养基悬浮培养20d左右的褐化细胞进行真空抽滤，所得细胞60烘干，细胞干重DWg·L-1为培养细胞的生长指标。细胞净生长量=收获时细胞干重-接种时细胞干重。1.2.3黄酮含量的测定和产量的计算总黄酮含量测定参考文献18。以芦丁

12、为标品，确定检测波长为510nm，以芦丁质量浓度Lmg·mL-1对吸光值A进行线性回归，得方程L=0.0768A-0.0004r=0.9997。将上述各试验处理中悬浮培养20d的细胞抽滤、烘干、粉碎，以丙酮为溶剂，取适量过60目筛的粉碎细胞干粉，振荡提取3次，每次24h，合并提取液，浓缩后用30%乙醇定容至0.50g·mL-1，取适量供试液，测定总黄酮含量X%，X%=V×Y/N×M×10-1，V为提取液体积mL，Y为供试液总黄酮质量浓度mg·mL-1，N为细胞质量g，M为稀释倍数。总黄酮产量mg·L-1=黄酮含量%×

13、;细胞生长量g·L-1×1000。1.3数据处理以上试验重复3次，采用DPS数据分析软件对试验数据进行Duncan分析P=0.05。2结果与分析2.1大量元素优化组合对悬浮培养细胞的生长和黄酮累积的影响如图1所示，大量元素优化组合后的培养基对大花金挖耳培养细胞的生长和黄酮化合物的累积均有显著的影响。从细胞生长量上看，处理和显著高于对照，处理、显著低于对照P2.2微量元素优化组合对悬浮培养细胞的生长和黄酮累积的影响如图3所示，在优化大量元素培养基的根底上，研究发现微量元素优化组合后的培养基对大花金挖耳培养细胞黄酮化合物的累积有显著的影響。从细胞生长量上看，4个处理均较对照有一

14、定的增高，但差异不显著;从黄酮含量上看，处理A、B、C显著高于对照P2.32，4-D对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响如图4所示，2，4-D在0.01.0mg·L-1时，对大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮生物合成有显著影响。培养基中添加2，4-D降低了培养细胞的干重收获量和黄酮产量;低浓度2，4-D0.1mg·L-1有助于黄酮生物合成，含量为2.08%，是对照的1.10倍P2.4KT对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响如图5所示，KT在0.01.0mg·L-1时，对悬浮培养细胞的生长影响显著，黄酮含量显著升高，黄酮产量差异不显著。细胞生长量先增后降，K

15、T质量浓度为0.1mg·L-1时，细胞干重收获量最大，为25.56g·L-1。随培养基中KT浓度的增加，细胞黄酮含量随之增加，黄酮含量达2.00%2.07%，是对照的1.061.10P2.5GA3对悬浮培养细胞的生长和黄酮类化合物累积的影响如图6所示，GA3在0.00.5mg·L-1时，对悬浮培养细胞的生长和黄酮生物合成产生了显著的影响。细胞生长量先增后降，GA3质量浓度为0.2mg·L-1时，细胞干重收获量最大，为25.29g·L-1，比对照高了0.12g·L-1，差异不显著;低质量浓度GA30.1mg·L-1有助于黄酮生

16、物合成，含量高达2.05%，是对照的1.08倍P3讨论与结论植物细胞培养黄酮化合物受培养基组分、激素、物理条件等多方面因素的影响，目前没有统一的标准条件适于所有的植物细胞培养，这就需要研究者对不同植物细胞培养生产黄酮的最正确条件进行研究12。培养基组分是植物培养细胞生长和次生代谢物积累中最直接、最重要的影响因素19。本文主要围绕提高大花金挖耳培养细胞黄酮产量的大量、微量元素及激素优化组合进行讨论分析。相对于高盐培养基MS和低盐培养基White，NT属于中等无机盐培养基，其中的N、P、Ca、Mg、K等大量元素对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮合成均产生了影响。本研究选取前期试验17中对大花金挖耳

17、细胞培养有显著奉献的NH+4、NO-3、K等大量元素进行进一步优化组合，发现当NT培养基中NH+4、NO-3、K+浓度依次为15.46、14.10、19.10mmol·L-1时，显著提高了黄酮含量和产量，分别为1.48%和363.95mg·L-1，分别是对照的1.21和1.26倍。可见，调节NT中总氮浓度或铵态氮与硝态氮的比例可显著促进培养细胞生长和黄酮生物的合成，这与水母雪莲、银杏、草莓等植物细胞培养黄酮的研究相似12。分析国槐槐角15、茶条槭20、玫瑰茄21细胞培养次生代谢物中氮源消耗的规律，不难推断，氮源消耗的前期主要用于细胞蛋白质、核酸等结构性组分的合成，后期主要用

18、于各种与次级代谢相关酶的合成22;铵态氮与细胞生长密切相关，硝态氮与黄酮、紫杉醇、没食子酸等次生代谢物的合成相关15，20-23;钾离子在细胞培养过程中发挥着“离子泵的作用，对细胞渗透压及营养物质的吸收具有调节作用24。微量元素是植物细胞酶的组成分子或活化剂，具有重要的生理生化作用18，25-26。笔者前期系统研究了NT培养基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+、Fe2+等8种微量元素单一因素对大花金挖耳悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响，本研究选取前期试验中对大花金挖耳细胞培养有显著奉献的MoO2-4、Zn2+等微量元素进行进一步的优化组合，发现大量元素优化

19、后的NT培养基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素浓度依次为3.0mol·L-1、0.06mmol·L-1、0.4mmol·L-1、0.2mol·L-1、0.4mol·L-1、10mol·L-1、0.2mmol·L-1时，培养细胞的黄酮含量和产量可分别到达1.89%和476.97mg·L-1，较优化大量元素的NT1培养基再次提高了黄酮的含量和产量。可见，微量元素含量虽少，但调节NT中微量元素浓度及其配比仍可显著促进细胞生长和黄酮生物的合成，说明微量元素在细胞培养过程中，

20、既独立发挥各自生理生化作用，同时又与大量元素及其他微量元素相互作用协同促进了大花金挖耳悬浮细胞的光合、呼吸、氮代谢等初生代谢，并提升了培养细胞黄酮类等化合物的生物合成能力。不同种类、不同浓度的植物生长素和细胞分裂素及其配比对植物细胞的生长和次生代谢产物的积累有着显著的影响27。本研究以NT+1.0mg·L-1NAA+0.2mg·L-16-BA为根本培养基，在大量元素和微量元素优化组合的根底上，再分别添加2，4-D、KT和GA3，结果发现低质量浓度2，4-D0.1mg·L-1有助于黄酮生物合成，2，4-D抑制黄酮的生物合成，添加2，4-D抑制了细胞的生长，总体降低了

21、黄酮的产量，这与2，4-D在许多植物细胞培养中抑制次生代谢物质的产生的研究结论相一致27。另外，低质量浓度KT0.1mg·L-1有助于细胞的生长，高质量浓度>0.1mg·L-1抑制了细胞的生长，附加KT0.11.0mg·L-1黄酮含量增加显著，0.2mg·L-1KT时，黄酮产量最高达517.87mg·L-1，是对照1.09倍，可见附加不同浓度KT对细胞生长和黄酮合成效果不同，这与KT在红花细胞生长及红花色素合成中发挥的作用相似28。低浓度GA3促进了细胞生长和黄酮的生物合成，高浓度GA3抑制了细胞黄酮的合成，这可能与GA3抑制查尔酮合成酶

22、有关29-30。总之，在前期研究的根底上，通过NT培养基中大量元素、微量元素逐步优化及添加激素等试验手段，大花金挖耳悬浮培养细胞黄酮含量和产量显著高于对照，影响顺序为：大量、微量元素优化，并附加KT的NT培养基>大量、微量元素优化的NT培养基>大量元素优化的NT培养基，黄酮含量大小依次是：2.05%、1.89%、1.48%，黄酮产量大小依次为：517.87、476.97、363.95mg·L-1。本研究系统优化了NT培养基中对大花金挖耳细胞培养有促进作用的相关因子，初步筛选得到了黄酮生产培养基，为实现大花金挖耳细胞培养工业化生产黄酮提供了试验依据。参考文献：【1】中国科学

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