色谱分析（中国药科大学） 第5章 现代色谱技术简介

1、.第五章 现代色谱技术简介第一节 高效毛细管电泳分析法（high performance capillary electrophoresis, HPCE）一、 概述1、 发展1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳第一次的自由溶液电泳。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳分析法。2、 特点 仪器简单、易自动化 分析速度快、分离效率高 操作方便、消耗少 应用范围极广二、 高效

2、毛细管电泳理论基础1、 高效毛细管电泳(HPCE)基本原理电泳：带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。当带电离子以速度在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：阻力：故：-离子所带的有效电荷；-电场强度；-离子在电场中的迁移速度；-平动摩擦系数 ( 对于球形离子：,-离子的表观液态动力学半径；-介质的粘度)。所以，迁移速度：淌度（mobility） ：单位电场强度下的平均电泳速度。淌度不同是电泳分离的基础。2、 电渗现象与电渗流(1) 电渗流现象当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电

3、渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。 (2) HPCE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度V电渗流表示，取决于电渗淌度和电场强度。电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；(3) HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。(4) H

4、PCE中电渗流的作用 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性； 电渗流的微小变化影响结果的重现性。3、 HPCE中影响电渗流的因素(1) 电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。(2) 毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；(3) 电解质溶液性质的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。缓冲溶

5、液离子强度增加，电渗流下降。(4) 温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。(5) 添加剂的影响 加入浓度较大的中性盐（如K2SO4），溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小； 加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向，如加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），电渗流增大； 加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。三、 HPCE中的参数1、 迁移时间（保留时间）2、 分离效率（塔板数）3、 分离度 四、 影响分离效率的因素区带展宽(1) 纵向扩散的影响在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽。由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率大分

6、子生物试样分离的依据。(2) 进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散，分离效率明显下降。(3) 焦耳热与温度梯度的影响 散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：减小毛细管内径；控制散热。(4) 溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。改善方法：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。(5) 其他影响因

7、素 电分散作用及“层流”现象。五、 高效毛细管电泳的分离模式1、 毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis ，CZE）最基本、应用广的分离模式电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；V电渗流 >V电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。2、 胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEC

8、C)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。电泳流和电渗流的方向相反，且V电渗流 >V电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；色谱与电泳分离模式的结合。3、 其它分离模式 毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis ，CGE） 毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF） 毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis ，CITP）

9、毛细管电渗色谱（capillary electroosmostic chromatography ，CEC）六、 应用 离子分析 药物分析 手性化合物分析 氨基酸分析 毛细管等电聚焦(CIEF) 核酸分析及DNA测序七、 进展 微型化 联用仪器 CE-MS 阵列毛细管凝胶电泳第二节 液相色谱质谱联用技术一、 概述发展：Horning、20世纪70年代。特点：集液相色谱的高分离效能与质谱的强鉴定能力于一体，对研究对象不仅有足够的灵敏度、选择性，同时还能够给出一定的结构信息，分析快速而且方便，具有其他分析方法所不能比拟的优点。地位：随着接口技术的不断发展，液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术在药物

10、分析等领域的地位越来越重要,分析范围更广。二、 LC-MS的基本组成LC-MS联用仪的基本组成包括HPLC装置、接口装置与离子源、质量分析器。1、 接口技术(1) 接口的作用 将洗脱剂及样品分子气化； 分离除去大量的洗脱剂分子； 完成对样品分子的离解； 在样品分子已经电离的情况下，最好能进行碰撞诱导解离（CID）。(2) 接口的种类LC-MS采用过的接口：直接液体导入接口(DLI)、传送带接口(MBI)、粒子束接口(PBI)、热喷雾接口(TSI)、大气压离子化接口(API)、电喷雾接口(ESI)、音喷离子化接口(SSI)、动态快原子轰击接口(FAB)、等离子体喷雾接口(PSP)、基质辅助激光解

11、吸离子化接口(MALDI)等。大气压离子化(API)接口的应用,彻底改变了LC/MS的面貌。使其迅速成为体内药物分析中应用最广的分析仪器。三、 大气压离子化接口技术（API）1、 分类 电喷雾离子化(electrospray ionization, ESI) 气动辅助电喷雾离子化(pneumatically assisted electrospray ionization) 大气压化学离子化(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性。2、

12、 电喷雾离子化（ESI）(1) 工作原理及结构示意图样品溶液通过毛细管导入大气压电离源内，在气化气的帮助下和源内毛细管终端与反电极之间强电场的作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。这些雾滴在热氮气流下蒸发，半径逐渐缩小，雾滴表面的电场不断增强到某一临界点时发生离子的场发射，或溶剂完全蒸发。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测得它们的质荷比。ESI过程： 静电喷雾 去溶剂 离子蒸发。(1) 特点 高的离子化效率； 多种离子模式供选择； “软”离子化方式使热不稳定化合物得以分析并产生高丰度的准分子离子峰；(2) 应用 小分子药物及其各种体液内代谢物的测定 农药及化工产品的中间体和杂质鉴定 大

13、分子的蛋白质和肽类的分子测定 氨基酸测序及结构研究 分子生物学领域的应用3、 大气压化学离子化（APCI）(1) 工作原理及结构示意图在大气压条件下采用电晕放电方式使流动相离子化，然后流动相作为化学离子化反应气（气相试剂）使样品离子化。样品分子的离子化通过质子化（）或电荷转移（）来实现。此外，还可通过去质子（样品为酸），电子捕获（卤素、芳香化合物）及形成加合物（如、）的方式来实现。(2) 特点 软电离接口技术； 电离过程只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定； APCI还与高流量的梯度洗脱和高低水溶液变换的流动相兼容，通过调解离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图。 四、 质量分析

14、器1、 四极杆质谱仪（quadrupole mass spectrometer）(1) 工作原理及结构示意图离子从一端进入四极杆，沿z方向恒速前进，由于在四极杆上加了直流电压和射频磁场（Vrf）,离子在x轴和y轴方向进行复杂振荡。有一个稳定的振荡能是特定的离子从四极杆的一端飞到另一端而没有碰到电极上。这一振荡取决于一个离子的质荷比。因此在一定条件下，仅一个质荷比的离子通过四极杆，其它离子由于不稳定的振荡将会碰到四极杆上而丢失。(2) 特点 在较低的真空度下工作； 扫描速度较快，有利于色谱仪联用； 四极质谱仪为低分辨率仪器； 扫描时间短（<100ms）,特别适合色谱峰的实时扫描； 缺点：四

15、极质谱仪还有质量歧视效应。 2、 飞行时间质谱仪（time-of-flight mass spectrometer, TOF MS）(1) 工作原理及结构示意图其中由103104V的电场脉冲将离子源产生的样品离子加速到无场的飞行管内。所有离子进入到飞行管内时具有相同的动能，但他们的飞行速度与它们的质量成反比，轻的离子较重的离子早飞行到达检测器，典型的飞行时间时130µm。(2) 特点 灵敏、分辨率高、快速； 理论上质量范围无限； 可以得到化合物的精确质量数； 结构简单。3、 其它质量分析器 离子阱质谱仪（ion trap mass spectrometer, ITMS） 傅立叶变换质谱仪（Fourier transform mass spectrometer, FTMS） 扇形磁场质谱仪（magnetic sector mass spectrometer）4、 串联质谱三级四极杆质量分析器（trilple-quadrupole analyzer）（空间串联质谱法）由三个顺序连接的四极杆