耐盐柳树BADH基因克隆及表达分析

1、耐盐柳树 BADH 基因克隆及表达分析大多数高等植物在受到盐、干旱等胁迫时会在细胞内大量积累甘氨酸甜菜碱(glycine betaine, 简称甜菜碱) 来提高自身抵抗逆境环境因子胁迫的能力1。甜菜碱作为季胺类水溶性生物碱，具有渗透调节功能，能够保护质膜的完整性，有助于植物适应非生物逆境2。耐盐柳树，杨柳科柳属，乔木，生长潜力大，与一般的柳树的区别是具有较强耐盐碱性，能在含盐4.0，Ph10.4的土壤中正常生长，是我国沿海滩涂主要的造林树种之一。具有适应性强，易繁殖，造林成活率高，生长迅速，无论在营造工业用材林，还是在防风固沙，水土保持，盐碱地改造等方面都有广阔的应用前景3。目前，国内外学者已

2、从川芎（Liqusticum churning Franch Hort）、枸杞（Lycium Barbarum）、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、甘菊(D endranthema lavandulifolium)、胡杨（Populus euphratica）、辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis）、梭梭（Haloxy lonammodendron）、盐爪爪（Kalidium foliatum）、大麦( Hordeum vulgare L.)、盐穗木（Halostachys caspica）等4-13植物的BADH基因也相继得到克隆。迄今为止，有关耐

3、盐柳树的BADH基因的研究还未见报道。本文从耐盐柳树中克隆了BADH基因, 探讨了其与其它品种或物种同源基因的相似性，并构建了系统进化树，并对其进行了序列分析和在盐胁迫下的表达分析，为耐盐柳树种质改良的研究奠定基础。1 材料与方法材料与方法1.1 植物材料江苏沿江地区农科所所选育耐盐柳树L0911新鲜叶片，取样后用液氮速冻存于-70冰箱待用。1.2 实验试剂引物的合成、Taq DNA 聚合酶、dNTP（10 m mol/L） 、DNA Marker 和 PCR 产物纯化回收试剂盒（生工 SK1141） 、质粒提取试剂盒（生工 SK1191 UNIQ-10） 、荧光定量 PCR 用试剂盒（SK8

4、661） 、常规化学试剂等均购自上海生工。pMD18-T 载体购自大连宝生物（TaKaRa） 。1.3 RNA提取和总cDNA的合成采用TRIzol试剂（Invitrogen 公司），并参照试剂说明手册提取总RNA。总cDNA的合成用AMV逆转录酶（BBI 公司）并按照反转试剂盒说明书进行。1.4 柳树L0911的BADH基因的克隆本研究以毛果杨（Populus trichocarpa）BADH 设计了引物 BADH F1：5 AGCTCTCAACTCACTAATCGAGT3；BADH R1：5TTATAGCTTGGCGGGAGACTG3。以 L0911 叶片总 cNDA 为模板，PCR 产物

5、经 1琼脂糖电泳后，切胶回收，并进行 T/A 克隆（pMD18T） 。阳性克隆送上海生工公司测序。所得的克隆的序列为 2 次独立 PCR 和 3 个以上质粒测序的结果。 1.5 植物 BADH 基因的分子进化分析在 GenBank 查找 BADH 基因的核苷酸和氨基酸序列相关的序列，使用Clustal W2 进行多序列比对，MEGA5.0 软件中 Neighbor-Joining（NJ）法进行建树，Bootstrap 值设为 1000。1.6 柳 L0911 的盐处理将L0911水培生长健壮的幼苗用200mmol.L-1NaCl溶液处理0，3h，6h，9h，12h，24h，48h，72h，分别

6、取新鲜嫩叶片；将L0911幼苗用0、100 mmol.L-1、200mmol.L-1 、300mmol.L-1 NaCl溶液处理12h，分别取新鲜嫩叶片。将样品用液氮速冻存于-70冰箱待用。1.7 实时荧光定量PCR分析L0911 BADH基因盐胁迫处理的响应根据测序结果，设计引物BADH F2（5GTGCCAAGTATTTGCGTGCTA3）和R2（5AAACAACCTGCGACATCATCC3），对L0911 BADH基因盐胁迫处理后的响应进行分析。内参基因参照关亚丽的等14，用ubiquitin-like（UBQ-L）为内参基因，引物为UBQ-L-F（5TGAGGCTTAGGGGAGGA

7、ACT3）和UBQ-L-R（5TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG3）。将上述盐处理的柳树L0911幼苗按各1.3方法进行总RNA提取以及cDNA合成。按柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（SK8661）操作配置PCR体系，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行定量PCR检测，测定其Ct值，用F=2-Ct公式15计算出样品间目的基因表达量差异。2 结果与分析结果与分析2.1 柳L0911 BADH基因的克隆用毛果杨（Populus trichocarpa）的PtBADH基因设计的引物F1和R1能成功的在柳L0911的cDNA模板中进行扩增（图1），且长度的大小符合预期。进一

8、步通过克隆测序后分析表明，L0911的BADH基因cDNA全长1539bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框（1512bp） 、终止密码子、5非编码区（27bp） 、共编码512个氨基酸。获得的氨基酸序列与PtBADH2,PeBADH2,PtBADH1,PeBADH2,拟南芥，水稻的相似性达到95.83%,95.03%,90.66%,91.25%,82.31% ,71.68%。说明本研究获得的基因与PtBADH2和PeBADH2是同源的。 图1 1%琼脂糖凝胶检测引物BADH-F1/R1扩增的PCR产物。泳道1含柳树cDNA模板PCR产物检测；泳道2为未加模板的阴性对照；M为标准分子量对照。2

9、.2 耐盐柳树氨基酸序列分析和系统进化树的构建根据方法1.5，在GenBank中查找植物BADH基因的核苷酸序列和氨基酸序列，用MEGA 5.0进行分子进化分析（图2）。图2表明，用植物的BADH氨基酸序列进行分子进化分析基本再现了用基因组序列(）对植物进行进化分析的结果。图2可见，本研究获得的柳树L0911的BADH基因与杨树属于相同的分支。在胡杨8、白骨壤16、麻疯树17等植物中，BADH基因的功能已有报道，本研究获得的BADH也应该具有生物学功能。图2 植物BADH基因的分子进化分析图。本研究中用于分析的基因序列的登陆号分别为：拟南芥(At03G48170)、滨藜（AAM19157） 、

10、豌豆（AC48392）、毛果杨（BADH1 POPTR015S08190；BADH2 POPTR0012S07730)、胡杨(PeBADH1 JN816361；PeBADH2 JN816362) 白骨壤( BAB18544) 、甜菜（BAE07176）、油菜（ AAQ55493）、大豆（Glyma05g01770）、陆地棉（AAR23816）、盐穗木（ ABO45931）、梭梭（ACS96437）、短芒大麦草（AAS66641）、麻疯树(ABO69575 )、盐爪爪( BI95806 ) 、枸杞( ACQ99195 ) 、麦冬( ABG34273)、水稻( Os08g32870)、高粱( Sb

11、07g020650 ) 、菠菜( ACM67311) 、碱蓬(,AAL33906 )、小麦( AAL05264)、玉米( GRMZM 2G016189)2.3 盐胁迫下L0911BADH基因的表达分析2.3.1不同浓度NaCl溶液相同时间胁迫下L0911BADH基因的表达特性柳L0911幼苗经不同浓度的NaCl溶液胁迫处理12h，提取叶片的总RNA，反转录后进行荧光定量PCR，并进行溶解曲线分析，所得溶解曲线呈现单峰可进行数据分析。从实时荧光定量中得到的目的基因BADH和内参基因UBQ-L的平均Ct值，以未进行NaCl胁迫处理12h的叶片中BADH基因的表达量为对照，将平均Ct值代入F=2 -

12、(Ct)公式进行计算并作图，得到图3。从图3可以看出L0911叶片中BADH基因的表达情况随着盐浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，在200 mmol.L-1NaCl胁迫下表达量最高，对照的1.90倍。说明一定浓度的NaCl胁迫可以诱导L0911的BADH基因表达量的增加，但盐浓度过高时BADH基因表达量又会下降。00.511.522.50100200300NaCl浓度 Concentration of NaCl(mmol/L)F值 F-value图3 不同的盐浓度处理后12小时的BADH基因的表达2.3.2相同浓度NaCl溶液不同时间胁迫下L0911BADH基因的表达特性用200mmol.L-

13、1NaCl溶液处理L0911幼苗，时间梯度为0、3、6、9、12、24、48、72提取叶片的总RNA，反转录后进行荧光定量PCR分析。以未经NaCl胁迫处理的叶片中BADH基因的表达量为对照，将目的基因BADH和内参基因UBQ-L的平均Ct值代入公式F=2 -(Ct)进行。计算并作图，得到图4。00.511.522.5036912244872时间 Time(h)F值 F-value图4 200 m mol.L-1NaCl处理不同时间胁迫下L0911叶片中BADH基因的表达量从图4可以看出，随盐胁迫时间的延长，叶片中BADH基因表达量呈现先升高后降低的趋势，在盐胁迫12h时达到峰值，叶片中BAD

14、H基因表达量是对照组的1.88倍，说明了盐胁迫能诱导该基因表达量的增加，在盐胁迫初期，L0911 BADH基因在3h时表达量低于对照，随着时间的延长，表达量逐步增大，在12h达到最高峰值，随着时间进一步延长，在72h时叶片中该基因的表达量低于对照表达水平。3 讨论植物在干旱、盐碱等逆境条件下可积累大量的甜菜碱，而植物体内甜菜碱的合成途径相对简单，主要经两步催化合成，即乙酰胆碱甘氨酸甜菜碱醛甘氨酸18。甜菜碱被合成后就不能被进一步代谢，积累在细胞中作为永久性或半永久性渗透调节剂19。因此，甜菜碱合成途径中的限速酶BADH被认为是最有希望的胁迫抗性基因之一，BADH的分子生物学与生物化学研究引起广

15、泛的关注。本研究从柳L0911所克隆到BADH基因，对该基因的基因结构、系统进化、表达模式进行了比较详细的研究。本研究采用同源克隆法从耐盐柳树L0911中扩增并克隆的BADH基因。测序结果表明，该基因含有1个完整的开放阅读框架，核苷酸序列全长为1539bp，推测的氨基酸序列全长为512个氨基酸残基。氨基酸序列同源性分析表明L0911的BADH基因与毛果杨、胡杨等同源性最近，为96%，与水稻的同源性为72%。L0911的BADH氨基酸序列同源性分析也表明BADH蛋白在高等植物中有高度保守的。植物在逆境条件下会积累甜菜碱，BADH基因的表达活性又直接影响甜菜碱的合成，本实验用荧光定量的方法检测L0

16、911在盐胁迫下，BADH基因在mRNA水平下的表达情况，结果表明，BADH基因是受盐诱导的，随着盐浓度的升高至200mmol/L，其表达活性增大，在同一盐浓度下，随着盐胁迫时间的延长，其表达活性也增大。Arakawa K等20研究结果大麦（Hordeum vulgare）BADH酶活性随着盐浓度的增加而增大，Reda等21研究也表明盐角草（Salicornia europaea）和碱蓬（Suaeda maritima）的BADH基因的mRNA在盐胁迫下的表达水平也增加，本文的研究结果与他们基本一致。总之，本文克隆的柳树L0911的BADH基因并研究了该基因在盐胁迫条件下mRNA水平的表达，为

17、进一步揭示L0911的耐盐机制及利用该基因进行遗传工程创造耐盐新种质奠定基础。参考文献1 Chen THH, Murata N. Glycinebetaine: an effective protectant against abiotic stress in plantsJ. Trends Plant Sci, (2008)13 (9):4995052朱先灿,胡鸢雷,王晓丽,等.两种滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及序列分析J.生物技术通报.2007(6):89-91. 3解孝满,李景涛,刘建军等.柳树无性系苗期试验分析J.山东林业科技,2008,(3):44-45.4周嘉裕,廖海.川芎甜菜碱醛

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