分子生物学-8

1、PCR (聚合酶链式反应聚合酶链式反应) PCR 是利用热稳定是利用热稳定 DNA 聚合酶在体外快速聚合酶在体外快速扩增扩增 (复制复制) 某一特定某一特定 DNA 片段的方法。片段的方法。PCR 原理原理Kary B. Mullis1983 发明发明 PCR 技术技术1993 获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖美国美国 Yellowstone 公园的热泉公园的热泉嗜热水生细菌嗜热水生细菌 (Thermus aquaticus)Taq DNA 聚合酶聚合酶PCR 过程过程1. 模板变性模板变性 (Denaturation) 双链双链 DNA 模板在模板在 95 C 变变性性为单链为单链 DNA。

2、2. 引物退火引物退火 (Annealing) 引物与单链引物与单链 DNA 互补并互补并退火。退火。3. 延伸反应延伸反应 (Extention) 耐热的耐热的 DNA 聚合酶催化聚合酶催化子链的合成。子链的合成。缓冲液缓冲液 (Tris-HCl, KCl)MgCl2 或或 MgSO4DNA 模板模板 上游引物上游引物 (upstream primer, sense primer)下游引物下游引物 (downstream primer, antisense primer) 底物底物 dNTPs热稳定热稳定 DNA 聚合酶聚合酶PCR 反应体系反应体系抑制抑制 PCR 反应的物质反应的物质1.

3、 长度：长度： 18 - 24 个核苷酸；个核苷酸；2. GC ：40 - 60；引物的设计引物的设计Tm = 69.3 + 0.41 (G + C%)引物长度引物长度为为 18 - 24 个碱基个碱基：Tm ( C) 4 (GC) 2 (AT)5 ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3 GC 12；AT 8Tm 4 X 12 2 X 8 64 C3. 四种碱基随机分布；四种碱基随机分布；4. 引物自身不应存在互补序列，以防引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；形成发夹结构；5. 引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer)；引物

4、的自身互补序列形成发夹结构引物的自身互补序列形成发夹结构两个引物分子形成二聚体两个引物分子形成二聚体6. 引物的引物的 5 端可添加限制性内切酶识别位点，便于端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向克隆。产物的定向克隆。5 CATATG33TTCGAA 5NdeIHindIIIhttp:/primer3.ut.ee//primer3plus/DNA 聚合酶聚合酶来来 源源PCR产物产物末端末端3 5 外切酶外切酶活性活性 (校正校正)Taq DNA 聚合酶聚合酶Thermus aquaticus3A无无Pfx DNA聚合酶聚合酶Therm

5、ococcus sp. KOD平端平端有有Pfu DNA 聚合酶聚合酶Pyrococcu furiosus平端平端有有Pwo DNA 聚合酶聚合酶Pyrococcu woesei平端平端有有Vent DNA 聚合酶聚合酶Thermococcus litoralis平端平端有有Deep Vent DNA 聚合酶聚合酶Pyrococcu sp. GB-D平端平端有有UITma DNA 聚合酶聚合酶Thermotoga maritima平端平端有有Tth DNA 聚合酶聚合酶Thermus thermophilus3A无无常用的常用的热热稳定稳定 DNA 聚合酶聚合酶待扩增片段：待扩增片段：1000

6、 bp引物引物 Tm 55DNA 模板变性模板变性: 94 C, 5分钟分钟;PCR 循环循环 (30 次次):94 C, 30秒秒; 50 C, 30秒秒; 72 C, 1分钟分钟;最终延伸最终延伸: 72 C, 7-10分钟分钟PCR 反应条件的设定反应条件的设定PCR 产物的检测产物的检测PCR 产物产物PCR 产物产物琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR 类型类型 标准标准 PCR 热起始热起始 PCR (Hot-start PCR)：提高：提高 PCR 反应的特异性反应的特异性 长长 PCR (Long PCR)：PCR 产物产物 5 kb 巢式巢式 PCR (Nested PCR)

7、反向反向 PCR (Inverse PCR) 菌落菌落 PCR (Colony PCR) 逆逆 (反反) 转录转录 PCR (RT-PCR) 实时定量实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 数字数字 PCR (Digital PCR, dPCR)巢式巢式 PCR用第用第 2 对引物来验证用第对引物来验证用第 1 对引物所扩增的对引物所扩增的 PCR 产物产物PCR反向反向 PCR环化环化 逆逆 (反反) 转录酶转录酶以以 mRNA 为模板合成为模板合成第第 1 条条 cDNA 链，然后通过链，然后通过 PCR 反应反应扩增出许多扩增出许多

8、cDNA 分子拷贝。分子拷贝。 RT-PCR 是是扩增扩增 mRNA 的快速的快速及及灵敏的方法。灵敏的方法。1. 检测某一基因在转录水平的表达检测某一基因在转录水平的表达2. 克隆特异的克隆特异的 cDNART-PCRRT-PCR 原理原理RT-PCR 过程过程三种用于反转录的下游引物：三种用于反转录的下游引物： 基因特异性引物基因特异性引物 (Gene specific primer) Oligo dT 引物引物 (Oligo dT primer) 随机引物随机引物 (Random primer) ：六核苷酸：六核苷酸 (hexamer)mRNA一步法一步法 RT-PCR：RT 反应与反应

9、与 PCR 反应在同一个试管中进行。反应在同一个试管中进行。两步法两步法 RT-PCR：RT 反应与反应与 PCR 反应在不同的试管中进行。反应在不同的试管中进行。 -actin GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 18S rRNA用用作作内参内参的管家基因的管家基因排除基因组排除基因组 DNA 污染污染 RNA 样品的方法样品的方法 引物引物 1 包含包含 Exon 4 的的 3 端序列和端序列和 Exon 5 的的 5 端序列，端序列，引物引物 2 包含包含Exon 5 的序列。的序列。 引物引物 1 包含包含 Exon 4 的

10、序列，引物的序列，引物 2 包含包含 Exon 5 的序列。的序列。如果如果 RNA 样品中有基因组样品中有基因组 DNA 的污染的污染 ，可用，可用 DNaseI 处理样品，以去除处理样品，以去除 DNA。实时定量实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 在在 PCR 反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号的积反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号的积累实时监测累实时监测 PCR 反应反应进程，对扩增的进程，对扩增的 PCR 产物产物进行定量进行定量分析的方法。分析的方法。 具有高度敏感性：用于检测微量的具有高度敏感性：用于检测微量的 DNA

11、或或 RNA 样品样品； 检测每一次检测每一次 PCR 循环中产物的积累；循环中产物的积累； 扩增反应结束后不需要对扩增反应结束后不需要对 PCR 产物进行电泳。产物进行电泳。荧光染料荧光染料* Emission spectra may vary depending on the buffer conditions. SYBR Green I 染料只结染料只结合双链合双链 DNA 但不结合单但不结合单链链 DNA，因此常用来检，因此常用来检测测 PCR 反应中反应中 DNA 的的合成。合成。缺点：非特异缺点：非特异 PCR 产物、产物、引物二聚体也结合引物二聚体也结合 SYBR Green I

12、 染料而产生荧光染料而产生荧光信号。信号。荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法PCR 循环循环R = Reporter (荧光报告染料荧光报告染料)Q = Quencher (淬灭物淬灭物)当当 TaqMan 探针完整时，探针完整时，荧光报告染料发射的荧荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。光被淬灭物所淬灭。在延伸反应中，在延伸反应中， 荧光报荧光报告染料被告染料被 DNA 聚合酶切聚合酶切除后与淬灭物分离，其除后与淬灭物分离，其荧光荧光信号被检测。信号被检测。 荧光探针法荧光探针法具有发夹结构的具有发夹结构的 Molecular Beacons 探针探针 方法方法优点优点缺点缺点SYBR Green

13、 I 法法适用性广适用性广灵敏灵敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出现非特异性带易出现非特异性带TaqMan 法法特异性高特异性高重复性好重复性好价格高价格高只适合特定目标只适合特定目标Molecular Beacon 法法高特异性高特异性荧光背景低荧光背景低只适合特定目标只适合特定目标设计困难设计困难价格高价格高 几种方法的应用比较几种方法的应用比较CYCLE NUMBERAMOUNT OF DNA01122438416532664712882569512101,024112,048124,096138,1921416,3841532,7681665,53617131,07218262

14、,14419524,288201,048,576212,097,152224,194,304238,388,6082416,777,2162533,554,4322667,108,86427134,217,72828268,435,45629536,870,912301,073,741,824311,400,000,000321,500,000,000331,550,000,000341,580,000,000plateau phase阈值阈值 (Threshold) 是在是在指数期适当位置设定的指数期适当位置设定的荧光检出界限值。荧光检出界限值。基线基线 (baseline) 是前是前15个

15、循环的荧光信号本底。个循环的荧光信号本底。扩增曲线扩增曲线Ct 值值Ct 值是值是 PCR 扩增过程中，扩扩增过程中，扩增产物的荧光信号强度达到设增产物的荧光信号强度达到设定的阈值时所经过的循环次数。定的阈值时所经过的循环次数。模板量越多，荧光达到模板量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即阈值的循环数越少，即 Ct 值越小。值越小。Log of template concentrationLog 模板起始浓度与模板起始浓度与 Ct 值值呈线性关系。呈线性关系。实时监测荧光信号积累的整个实时监测荧光信号积累的整个 PCR 进程，通过已知浓度进程，通过已知浓度的标准品的标准品 (标准曲线标准曲线)

16、对未知浓度的样品进行定量分析。对未知浓度的样品进行定量分析。CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)Real-Time QPCR System Mx3000P (Agilent) 激发光源：石英卤钨灯激发光源：石英卤钨灯检测器：扫描光电倍增管检测器：扫描光电倍增管 (PMT) 多重检测：多重检测：4 个光学通道个光学通道样品量：样品量：96 孔，反应体系孔，反应体系10 - 100 ul多重检测：多重检测：5个光学通道，每孔可检测个光学通道，每孔可检测5个目的基因个目的基因样品量：样品量：96 孔，反应体系孔，反应体系 1 - 5

17、0 ul 数字数字 PCR 技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液技术是通过将微量样品作大倍数稀释和分液 (partitioning)，直至每个样品中所含有的待测分子数不会，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过超过 1 个，再将所有样品在相同条件下进行个，再将所有样品在相同条件下进行 PCR 扩增，扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。 不需要内参对照，对样品进行绝对定量。不需要内参对照，对样品进行绝对定量。数字数字 PCR (Digital PCR, dPCR)用用 dPCR 技术检测单细胞技术检测单细胞 (神经元神经元)

18、中的转录本中的转录本Farag N, et al. Digital PCR to determine the number of transcripts from single neurons after patch-clamp recording. BioTechniques 2013, 54:327-336. (single cell)Subarray OpenArray plate contains 48 subarrays with 64 through-holes. Each through-hole is 300 m in diameter and 300 m in depth. 1个微滴个微滴 1 nL1个样品个样品 20000 微滴微滴微滴式数字微滴式数字 PCR(Droplet digital PCR, ddPCR