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文档简介
1、 分类号 学号 U D C 密级 学 位 论 文 抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用李舜曦指导教师姓名: 秦爱建教授,扬州大学兽医学院, 江苏扬州,225009 申请学位级别: 硕 士 学科专业名称: 预防兽医学 论文提交日期: 2011年5月 论文答辩日期: 2011年6月 学位授予单位: 扬 州 大 学 学位授予日期: 答辩委员会主席: 论 文 评 阅 人: 2011 年5 月抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用国家自然科学基金项目(30371070)研究生:李舜曦指导教师:秦爱建 教授扬州大学二一一年六月目 录符号说明1摘 要3Abstract5
2、文献综述7参考文献17研究内容一 抗MDV UL13蛋白单克隆抗体的研制251.材料252.方法273 结果313 讨论36参考文献37研究内容二 利用单克隆抗体研究MDV UL13391. 材料和方法392结果433讨论47参考文献:48研 究 成 果50致 谢51扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书525353李舜曦:抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及UL13蛋白激酶的纯化符号说明AIVAvian influenza virus禽流感病毒Ampampicillin氨苄青霉素APalkaline phosohatase碱性磷酸酶DAB3,3-diaminoben3,3二氨基
3、联苯胺DMEMDulbeccos modified eagle medium基础培养基FCSfetal calf serum犊牛血清FITCfluorescein isothiocynate异硫氰酸荧光素Hhypoxanthine次黄嘌呤HATHypoxathine-aminopterin-thymidine(medium)次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷HRPhorsedradish peroxidase辣根过氧化物酶IBDVInfectious bursal disease virus传染性法氏囊病病毒IFAimmunofluorecent assay免疫荧光试验IgGimmunoglobulin
4、 G免疫球蛋白质GIPTGIsopropylthio-D-galactodise异丙基硫代-D-半乳糖苷LBLuria-Bertani mediumLB培养基McAbmonoclonal antibody单克隆抗体NCnitrocellulose硝酸纤维素NPnucleoprotein核蛋白NTnucleotide核苷酸ODoptical density光密度OPDo-phenylenediamine邻苯二胺PAGEpolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate buffer sodium磷酸盐缓冲液PCRPolymerase C
5、hain Reaction聚合酶链式反应PEGpolyethylene glycol聚乙二醇SDSsodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠Sf9spodoptera frugiperda clone 9草地贪夜蛾卵巢细胞Tthymidine胸腺嘧啶TEMEDN,N,N,N-teral ethylene diamineN,N,N,N-四甲基乙二胺Tristris hydrochloride三(羟甲基)氨基甲烷WBWestern blot蛋白免疫印迹试验X-gal5-Bromo-4-Chloro-3Indoly-D-Galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷计量
6、单位Lliter升gmicrogram微克mLmillter毫升rpmrotation per minute转/分Lmicro liter微升hhour小时mol/Lmol/litter摩尔/升minminute分钟mmol/Lmillimol/litter毫摩尔/升dday天mol/Lmicromol/litter微摩尔/升Uunit单位pmolpicomol皮摩尔kDakilodalton千道尔顿kgkilogram千克bpbase pair碱基对ggram克kbkilobases千碱基对mgmilligram毫克Vvolt伏特抗马立克氏病病毒UL13蛋白单克隆抗体的研制及其初步应用研究生
7、:李舜曦导 师:秦爱建教授摘 要1 抗马立克氏病病毒UL13蛋白特异性单克隆抗体的研制我们实验室在Genbank上查找出公布的马立克氏病病毒不同毒株的UL13基因序列,发现各种毒株的基因序列基本一致。利用DNAstar分析软件将CVI988病毒UL13蛋白基因序列翻译成相应的蛋白质。再利用分析软件对该蛋白质进行分析,得到其高亲水区、高抗原性表达区所在位点。选择其高抗原性、高亲水性肽段,合成小肽。利用合成的高抗原性、高亲水性小肽作为免疫原对小鼠进行免疫。经腹腔免疫注射8周龄雄性Balb/c小鼠。第一次免疫:完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽20ug/只。两周后第
8、二次免疫:不完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽50ug/只。两周后第三次免疫:不完全佐剂与等体积的多肽混合,腹腔免疫,0.2-0.3ml/只,含多肽70ug/只。10天后第四次免疫:取一只balb/c小鼠.腹腔免疫,0.2-0.3ml,含多肽100ug/只。第四次免疫后72小时-96小时取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合.利用小肽包被的ELISA板反复筛选阳性克隆,并经有限稀释法3次亚克隆。结果获得了4株特异性分泌抗马立克氏病病毒UL13蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为MDV UL13- DE4,MDV UL13- CF8,MDV UL13- F
9、B3,MDV UL13- EC3。这4株单抗能与MDV病毒发生间接免疫荧光特异性反应。并具有具有ELISA和Western-blot反应性。这些单抗的研制为UL13蛋白功能的相关研究奠定了坚实基础。2 利用单克隆抗体研究MDV UL13 为研究病毒复制表达过程中, UL13蛋白在细胞上的定位,病毒在复制过程中,UL13蛋白的功能以及表达含量。通过利用特异性的抗MDV UL13的单克隆抗体,运用间接免疫荧光试验、Western-blot试验,对CVI988弱毒疫苗感染鸡胚成纤维细胞进行了MDV UL13蛋白检测,以考察UL13的细胞定位。以及用Western-blot试验鉴定原核表达蛋白是否能反
10、应。并且通过一种新的方法诱导表达邓旭芳所构建的大肠杆菌表达UL13蛋白,并运用小鼠多抗血清加以验证,使得纯化出的蛋白能够得到运用,开辟了纯化蛋白的新途径,为今后蛋白质激酶的纯化提供了新的方法,并为研究其激酶功能奠定了良好的基础。 Development of Monoclonal Antibodies to UL13 protein of Mareks disease virus and its preliminary applicationM.S Candiate:Shunxi LiSupervisor: Prof.Aijian QinAbstract1 Development and Ch
11、aracterization of Monoclonal Antibody to UL13 protein of Mareks disease virusOur laboratory find out in Genbank published on Marek's disease virus UL13 gene sequences of different strains, Found that the gene sequences of various strains is consistent. Using DNAstar analysis software translated
12、CVI988 virus UL13 protein sequence into the corresponding protein. Re-use analysis software to analyze the protein, obtain the sites of the high hydrophilic areas,high expression of antigen. Choose the high antigenicity and high hydrophilic peptides, synthetic peptides. Use the high antigenicity,hig
13、h hydrophilic small peptide as immunogen for immunization of mice. Intraperitoneal immunization 8 weeks Balb/c mice. First: Mixture Complete adjuvant and peptide, intraperitoneal immunization 0.2-0.3ml, containing peptides 20ug/one Mouse.The second time in two weeks: incomplete adjuvant and peptide
14、mixture, intraperitoneal immunization 0.2-0.3ml, containing peptides 50u/one Mouse. The third time in two weeks: incomplete adjuvant and peptide mixture, intraperitoneal immunization 0.2-0.3ml containing peptides 70ug / one Mouse. The fourth time in 10 days: take a Balb/c mice, intraperitoneal immun
15、ization 0.2-0.3 ml, containing peptides 100ug/one Mouse. After 72 hours-96 hours,fusion spleens of mice lymphocytes and SP2/0 myeloma cells. Use of small peptide-coated ELISA plates selected positive clones repeatedly, and 3 times by limiting dilution subcloning. Result obtained a specific anti-secr
16、etory protein of Mareks disease virus UL13 positive hybridoma cell lines. Named MDV UL13- DE4,MDV UL13- CF8,MDV UL13- FB3,MDV UL13- EC3. This 2 monoclonal antibody can specifically react with MDV virus. The development of monoclonal antibodies use for UL13 protein function research has laid a solid
17、foundation.2 Using monoclonal antibody research MDV UL13 To study the expression of the process of viral replication,UL13 protein localization in cells. In the Virus replication, UL13 protein function and expression contents. Through the use of specific monoclonal antibodies against MDV UL13, Using
18、indirect immunofluorescence assay, Western-blot test, detect CVI988 attenuated infection of chicken embryo fibroblasts for the observation of MDV UL13 protein detection, to examine the cellular localization of UL13 protein. And identified by Western-blot test whether the prokaryotic protein response
19、. A new approach through induced expression of Deng Xufang constructed UL13 protein of E. coli. And using mouse antiserum to verify, Makes the purified protein can be used, Opened up new ways of purified protein, in the future provide a new method of purification Protein kinase. And to study its kin
20、ase function has laid a good foundation.文献综述 利用多肽作为免疫原的研究进展多肽疫苗是一种新型疫苗,因其含有能被机体淋巴细胞识别的抗原表位,故可模拟靶抗原,并诱导机体产生保护性免疫应答。1 肽疫苗的合理性与MHC类分子一样,MHC类分子亦是多态性蛋白,它们对启动机体免疫应答具有非常重要的作用10。当外源性蛋白在抗原提呈细胞的初级或次级溶酶体内降解,所产生的肽与MHC类分子结合,并被转运至细胞膜表面,肽/MHC复合物同时被T细胞共同识别,它们刺激T辅助细胞(CD4+)及抗体反应23。Peters等的观察表明,在溶酶体结构中,抗原受到广泛的蛋白水解作用,而
21、较容易降解的肽段很少能与MHC分子结合34。 在某些情况下,由抗原提呈细胞降解的蛋白可被直接在体外用化学或蛋白水解方法裂解的蛋白以及合成的肽段所代替56。抗原性肽则可绕过由抗原提呈细胞完成的处理过程,而直接与细胞表面的MHC类分子结合57。 Roy等在鼠MHC(即H-2)多态性及T细胞特异性方面的研究发现,针对噬菌体阻遏蛋白的T细胞反应,因小鼠的H-2不同而有改变,如B10.BR鼠的T细胞可识别3个不同的抗原表位,而BALA/C和C57BL/6鼠的T细胞仅对一个表位反应58。显然,MHC的多态性优势在物种水平上影响个体能否产生保护性免疫43。这样有些个体有较广泛的免疫应答,而另一些只能得到部分
22、保护42。在另一方面,有关破伤风毒素(tt)表位分析发现,P2能与大多数的DR等位基因产物结合。这些类分子在链上的残基有所不同,而拥有相同的链36。推测可能链提供了与P2相互作用的位点,使P2的相似构型能被来自不同DR等位基因产物修饰的提呈细胞识别65。因此从理论上推测,合理设计的靶肽若同时能具备免疫原性以及被提呈的广谱性,则有克服MHC多态性限制的可能性,并发展成为对大多数人群有保护力的肽疫苗69。2 肽疫苗的设计测绘T或B细胞所识别的抗原表位的工作近年来颇受重视,T细胞受体(TCR)能识别在抗原提呈细胞表面上的MHC类分子-抗原二重复合物78。基于一些模型研究的推测,TCR的杂二聚体有类似
23、Fab片段的多肽叠合77。和链各有3个互补性决定区域(CDR)76。在四级结构中,每条链的CDR3互相比邻,它们与CDR1及CDR2疏远。推测TCR的CDR1及CDR2环状结构相对保守,与MHC螺旋结构相接触,而CDR3为高度变异区,位于MHC抗原结合位点的中央43。后者能与MHC结合裂口配合。对于抗原/MHC/受体三重复合物的分子特征的了解尚很有限,但T表位几乎是一个小段肽的事实,使我们可以利用一些技术从蛋白质的初级结构上寻找有意义的表位47。2.1 使用各种演段法(Algorithms)预测表位,而后进行化学合成。De Lisi提出T表位为两性分子(Amphipathic)的结构假说,即分
24、子的一部分是亲水的,另一部分是疏水的,分子的极性部份可能被T细胞受体识别,非极性部份可能与提呈细胞作用63。某些研究结果支持此假设:T表位与抗原分子螺旋结构的偶极性之间呈强烈相关62。在此仅以Margalit的最优演段法加以说明:(1) 演段法的理论基础;当序列中的氨基酸随或长或短的周期改变其极性时,即可形成偶极性结构。(2) 限制性;适合于大于11个氨基酸,并小于20个氨基酸的片段。(3) 检测方法;按分离的Fourier转换及正弦曲线的最小平方配合计算能谱,后者将应用到适当的疏水性的序列上;当区域的最大强度接近1000的频率出现时,则反映为每一螺旋为3.6个残基的周期性,即偶极性螺旋结构;
25、对于具有良好周期性的区域进一步确定形成稳定的偶极性结构的可能性;用基础数据训练此程序,建立成为一个偶极片段所应达到的阈值49。Margalit检查了23个已知的抗原表位,其中18个表位用此程序得以确认,敏感性达75%46。Rothbard-Tayler提出T表位的线性结构(motif structure)的假说,自然他们的演段法与螺旋结构的演段法不同44。愈来愈多的实验结果表明并非所有的T表位都遵循这些作者提出的规则。2.2 化学合成肽根据Rothbard-Tayler的T细胞线性表位假说,van der Zee用Pepscan方法合成一批短线性肽,用于确定已知序列的抗原中的T表位66。所谓P
26、epscan方法,是借助自动程序,少量的肽在活化的、排列成微量滴定板式的聚乙烯条上按已知的氨基酸序列顺序合成66。一般短肽为8-10个氨基酸。在合成及去保护后,肽任然附着在聚乙烯条上67。再用较缓和的条件将合成的肽从固相上解离,使之与抗原提呈细胞相互作用,在被T细胞识别67。用此方法确定大分子蛋白质一级结构的表位较繁琐的。2.3 肽疫苗的合理应用合理设计的体外合成或基因重组产生的肽能被机体抗原提呈细胞识别,后者将其提呈给相关的淋巴细胞,诱导机体保护性反应,并在此过程中产生记忆细胞;多重成分组成的疫苗有可能为较大范围人群提供保护84。这些特点表明肽疫苗是符合当今对理想疫苗的要求。但由于对事物认识
27、的阶段性、局限性,在实践中必将遇到各种问题,如抗原性靶肽在血浆或抗原提呈细胞的表面继续被降解;一般来说抗原性肽的构象介于变性与自然构象之间,如果有保护力的淋巴细胞要求抗原的自然构象,那么合成肽免疫动物的淋巴细胞将不能识别亲本、自然蛋白,而后者用Pepscan方法亦测绘不出B表位;或抗原表位涉及不连续的多肽骨架区域;普通存在的MHC分子限制性;以及编码T细胞受体的多态性等84。2.4 口蹄疫化学合成肽苗的保护作用口蹄疫为主要的动物传染病之一, 病毒侵袭反刍动物和猪,易于传播,儿乎遍及世界各地83。预防此病的疫苗为灭活疫苗,在幼地鼠等组织培养上制备。虽然疫苗有一定预防效果,也存有缺点,热稳定性不好
28、, 尤其热带地方使用受限制;在欧洲由于疫苗灭活不当而造成该病流行83。有些学者借助基因工程的技术试图利用大肠杆菌生产多肽疫苗,但表达蛋白的活性很低,还存在不少困难。作者们致力于化学合成肽来免疫, 发现有一定保护作用82。口蹄疫病毒属小核糖核酸病毒科(picornaviridae)的口疮病毒属(aphthovirus genus),含有一分子的感染性单链RNA,分子量2.6×106,有4个多肽(VP1VP4)。已知VP1具有免疫活性82。目前借助重组DNA技术,口蹄疫病毒A型2个株和O型的1个株的核苷酸序列已搞清楚,并证明免疫活性部位在VP1分子羧基端的一半83。于是, 作者合成了个肽
29、, 相似于VP1氨基酸序列氨基末端141的肽有四个片段,羧基未端200213的一个片段, 近分子中间部分的二个片段(141160和151160)84。将这些肽结合到血兰蛋白上免疫家兔, 结是仅中间部位的片段(141160)和羧基末端肽(200213)可以引起家兔产生抗体反应,这种抗体可中和同源病毒, 对异型病毒有低的交叉反应。 接种合成肽所得抗血清的型特异性和接种完整病毒相仿83。将合成肽和等量弗氏完全佐剂或氢氧化铅凝胶混合, 皮下接种给豚鼠(20或200 ug)。另设接种1或10 ug提纯的灭活病毒颗粒为对照。35天后, 一方面取血清中和抗体, 同时于爪心接种104ID50的同源病毒进行攻击
30、。结果证明, 肽141160诱导产生的中和抗体可保护动物免受攻击感染。300 ug时可提供完全保护, 既使20ug也有一定保护作用。中和抗体水平与对病毒攻击的保护能力呈正相关83。在试验中指出, 一次接种合成肽141160可引起充分的中和抗体以保护豚鼠对抗后来用口蹄疫病毒的攻击82。由肽引致的中和抗体滴度比用病毒衣壳蛋白VP1免疫大儿个级数, 不论这种衣壳蛋白是由病毒颗粒裂解产生或是由大肠杆菌表达83。引起这种差异的原因可能是由合成肽引起的抗体比VP1更接近于病毒颗粒引起的相关质量, 有可能分离的VP1由于有其它衣壳蛋白提供的骨架影响其不能适当的折叠, 结果对免疫系统所存在的免疫优势部位不能充
31、分显露出来。相反, 小的游离肽可能符合于病毒颗粒所能显露的结构特征。这些就构成了合成肽苗进一步研究的意义84。2.5 FMDV多肽疫苗自80年代初开始,许多科学家在探索应用基因工程技术手段,研制新颖疫苗来预防FMD。1982年,Bittle等证实FMDV VP1中141160位肽段(20肽)和200213位肽段(14肽)是主要的免疫活性肽。Broekhuigsen、Morgan等对FMDV生物合成多肽苗的免疫原作出估价84。尤永进、郑兆鑫、盛祖恬于80年代中期开始,首先完成了“O”型FMDV VP1中20肽基因片段化学合成、克隆和表达,构建成质粒pXZ42,并完成了20肽-14肽和20肽-14
32、肽-20肽基因片段的串联、克隆和表达,构建成质粒pXZ12和pXZ500,估价了它们对家兔保护性抗体的免疫应答。而质粒pXZ500表达多肽产物对豚鼠和猪体保护性抗体的免疫应答83。在关于Winther、Broekhuigsen及Morgan等在关于FMDV基因工程多肽苗的报道中指出,他们用于动物实验的多肽苗都是基于20肽基因的重复拷贝。而尤永进等报道的多肽苗是20肽-14肽-20肽基因的串联。以前的研究已经证明,14肽本身虽引起免疫应答反应的功能较差,但当与20肽共同存在时,可以显著提高免疫应答水平。另外,与他人的研究所不同的,尤永进所构建的质粒pXZ500目的基因的插入位置在-半乳糖苷酶的C
33、端,以往的报道目的基因的插入位置均在N端42。质粒pXZ500表达产物经初步提纯后,作为免疫原分别免疫豚鼠和猪,免疫活性肽的总剂量分别为豚鼠32g/头,猪0.346mg/头,均为两次免疫。第一次免疫后40天和45天,两者的保护性抗体的乳鼠保护指数均达2.0以上,用各自50个发病单位强毒攻击,均可获得100%保护。在总剂量相同的情况下,对豚鼠和猪作一次免疫,结果显示,豚鼠可以获得较为理想的结果,而猪的实验结果却不甚理想。由此,尤永进等得出这样的结论:质粒pXZ500表达的免疫活性肽对豚鼠和猪产生的保护性抗体的免疫应答既有平行相关性又有一定的差异,而当免疫剂量较低时,两者均不能获得满意结果41。
34、UL13蛋白研究进展疱疹病毒HSV-1 UL13是一种在细胞培养物中调节最佳的病毒复制状态的病毒蛋白激酶22。鉴定蛋白激酶的底物是一个去解释其功能的机制的决定性步骤。用我们发展的系统去分析特意的UL13蛋白激酶的活性,我们直接显示UL13蛋白激酶直接磷酸化病毒蛋白ICP22以及UL49,就如同先前报道的假定底物。我们同样经鉴定UL41当做先前的未报到的异常的UL13底物12。这一数据将要充当一个使UL13影响病毒复制的基础并明确机制12。单纯疱疹病毒是一种在世界范围内在人类身上引起多种疾病种类的病毒,包括皮肤粘膜的感染诸如生殖器疱疹,唇疱疹,有可能性的视力损伤性疱疹,以及疱疹性脑炎或弥散性疾病
35、10。HSV大约编码大于80中基因,在这些基因中包括编码UL13的病毒基因13。 HSV-1 UL13是一种包装在皮肤内的丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶,其病毒结构组件位于核衣壳与包膜之间18。UL13在有病毒复制的细胞培养物中扮演了一个重要的角色,从UL13的缺失株上可以显示出病毒受损的复制能力19。众所周知通过蛋白质激酶的磷酸化作用所得到的蛋白质具有最普通的,有效的能改变靶蛋白活力的修饰能力2。通过特异性的蛋白激酶磷酰化目标蛋白调节一些细胞功能诸如:转录,翻译,细胞周期的调节,蛋白降解,细胞凋亡等等。可以想象的是:HSV利用UL13调节其自身的复制过程,并且通过磷酸化病毒以及细胞蛋白修改细胞的结构
36、40。实际上,据报道在病毒基因的表达,细胞凋亡UL13扮演及其复杂的角色52。UL13通过磷酸化特殊的病毒以及细胞蛋白底物发挥自己的功能4。鉴定这些底物的目的是为了说明UL13调节病毒基因的表达,细胞凋亡以及子代病毒的流出这些功能的关键机制7。迄今为止,UL13为数众多的假定底物包括ICP22, Us1.5, ICP0, gI/gE, UL47, UL49, UL13, p60,延伸因子(EF-1d), 酪蛋白激酶 IIb (CKIIb), RNA聚合酶II以及Us3,已经被报道。磷酸化作用以及翻译后加工的ICP22, Us1.5, ICP0, gI/gE, UL49, p60, EF-1d,
37、 RNA聚合酶II已经被证明在被UL13突变株感染的细胞中均被减少,得出在被感染的细胞中UL13调节的磷酸化假定的底物27。然而,在UL13的突变体病毒试验中,UL13能直接磷酸化假定的底物,其不仅能够通过磷酸化假定的底物有活性的诱导其他蛋白激酶22。因此,在体外研究中,必需证明的是通过酶的直接磷酸化底物是明确的并且直接的32。在体外研究中,已经报道有两种方法显示了磷酸化底物的特异性33。首先, 运用利用UL13的多克隆抗体采用免疫沉淀(法),ICP0与gI/gE显示出通过UL13的磷酸化所产生的作用。在这一激酶体外研究含量测定中,无论如何,其可能存在的蛋白激酶的活力,通过抗体检测到的利用UL
38、13免疫沉淀(法)不仅伴随着Us3或其他共沉淀物62。近来,在体外研究中,我们发展了更多的可靠的系统去分析特殊的UL13蛋白激酶的活力。在这一系统中,我们表达了大量的UL13的融合谷胱苷肽重组物转移酶类,在昆虫细胞中,运用重组杆状病毒群运用酶活性的去获得高纯度的UL13。我们同样运用UL13激酶否定的突变株,运用不变的赖氨酸176去取代甲硫氨酸去消除具有激酶活性物,去检测到的运用纯化的重组UL13去引起的由于在纯化期间由于激酶污染物而产生的可能性72。运用纯化的重组UL13以及其突变物在体外激酶测定中,比运用多克隆抗体产生的免疫沉淀的UL13的量能够使我们检查到更多的特异性的UL13比活力73
39、。事实上,我们先前证明到,不能通过Us3的直接磷酸化去结合细胞蛋白,另一种通过HSV-1编码的蛋白激酶,在另一个Us3蛋白激酶表达系统中通过利用重组的GST-Us3以及其激酶消极的突变株(纵使其已经被报道能够能够通过Us3的免疫沉淀使其有效的磷酸化)来结合蛋白81。运用我们的显像系统,我们显示出:EF-1d以及Us3比直接通过UL13磷酸化的底物更能有说服力的证明,现今为止我们并不知道是否有另一种假定的底物能够UL13直接磷酸化82。现今为止:我们验讫假定的UL13底物在早期是否能够通过UL13直接磷酸化。我们同样尝试识别先前的未报到的UL13异常底物62。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL1
40、3是一种包装成病毒颗粒的病毒蛋白激酶,其可以调节ICP0最佳表达;并调节一系列晚期表达的蛋白质,其中包括在感染细胞中的UL418。为了研究有蛋白质激酶活性的UL13在病毒复制中的作用,Michiko Tanaka等采用重组病毒的方法,替代了UL13中不变的赖氨酸,使得该重组病毒所表达的UL13无蛋白质酶的活性11。其重组病毒在感染细胞传播十代后,其产生的蚀斑大小比野生型毒株略小,但在被感染的细胞中其产生的UL41,ICP0积聚物的量与野生型毒株相比并没有明显变化26。这一结果表明蛋白质激酶UL13在细胞培养病毒复制的中起着重要的作用,但其对UL41,ICP0的表达,并非起着至关重要的作用28。
41、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)已知至少编码84个不同的蛋白质。单纯疱疹病毒1型的基因主要由三个重要的组别组成,包括, and 16。这些基因的表达都通过相互协同,顺序级联的方式逐步表达25。在这些病毒的基因中,UL13,UL39,US3因其编码蛋白激酶,所以特别引起人们的关注53。(Roizman and Knipe, 2001).众所周知,蛋白质磷酸化的蛋白质激酶是最常见,最能有效修饰,改变目标蛋白活性的酶类37。由特定的蛋白质激酶所磷酸化的靶蛋白,调节许多蛋白质功能,比如转录,翻译,细胞周期调控,蛋白质的降解,凋亡等等30。可以想象的是,HSV-1利用病毒的蛋白激酶去调节自身的复制过程,并
42、通过磷酸化病毒和细胞的结构蛋白去修改细胞的结构20。事实上,据报道病毒蛋白激酶在病毒基因的表达过程,细胞凋亡以及原子核从病毒核体的释放中扮演着很多种角色63。(Leopardi et al., 1997; Perkins et al., 2002;Reynolds et al., 2002)关于由HSV-1 UL13 基因所表达的蛋白激酶所报道的内容如下:HSV-1 UL13是一种丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶,并且UL13的氨基酸序列在疱疹病毒亚科中一直都是保守的。(Chee et al., 1989; Daikoku et al.,1997; Kawaguchi et al., 2003; Smi
43、th and Smith, 1989) 如今我们所指的这些保守病毒蛋白激酶就是保守性的疱疹病毒蛋白激酶(CHPKs) 70。自从CHPKs在疱疹病毒中发现之后,他们在疱疹病毒通过磷酸化通用的宿主细胞靶蛋白以及保守的疱疹病毒基因产物以用来复制自身变得功能中扮演了一个保守的角色74。现今CHPKs在疱疹病毒中经鉴定的仅有的共同底物是细胞转录翻译因子EF-1。虽然,磷酸化作用的生物学重要性任然不清楚,但CHPKs和EF-1之间相互影响的特征性在于细胞蛋白激酶cdc2和CHPKs磷酸化相同的氨基酸残基EF-1。(Kawaguchi and Kato, 2003; Kawaguchi et al., 2
44、003) 这一观察结果表明CHPKs有可能性地与细胞蛋白激酶cdc2表现出同样的功能79。现今HSV-1 UL13磷酸化在体内的酪蛋白激酶II亚基支持这一假说60。此外,据报道爱泼斯坦病毒的CHPK,BGLF4以及cdc2磷酸化EBV调节蛋白的相同的位点,EBNA-LP and EBNA-2,这两种蛋白对体内,体外的蛋白转录物的活性始终具有决定性作用38。(Kato et al., 2003; Yokoyama et al., 2001; Yue et al., 2005)HSV-1 UL13在细胞培养物的复制中扮演了一个重要的角色6。包括在鼠皮肤细胞系,以及幼仑鼠肾细胞系中,UL13的缺失株
45、展示其在复制中的受损能力。虽然,UL13的功能在HSV-1感染的细胞中任然不清楚,UL13的缺失株在感染鼠皮肤细胞以及BHK细胞后能减少蛋白ICP0以及一系列蛋白包括UL26,UL26.5,UL38,UL41以及US11的表达(Ng et al., 1997; Ogle and Roizman, 1999; Poon et al.,2000; Purves et al., 1993; Roizman and Knipe, 2001)。这一结果表明UL13影响感染细胞的病毒基因的表达物9。UL13蛋白激酶表现出能够磷酸化调节病毒与细胞中的各种蛋白55。其中包括gI/gE, ICP0, ICP22
46、, Us1.5, VP22, EF-1, p60以及RNA聚合酶。因为在UL13缺失的病毒体所感染的细胞中,以上几种所提及的蛋白的翻译后修饰均表达受阻或减少。(Bruni et al., 1999; Coulter et al., 1993; Durand et al., 2005;Kawaguchi et al., 1998, 2003; Long et al., 1999; Ng et al.,1998; Ogle et al., 1997; Purves and Roizman, 1992) 有趣的是,就ICP0以及蛋白子集的蓄积而言,同样能编码ICP22以及US1.5的缺失株22基因的
47、表型,不能够从UL13的缺失株病毒分化出来。(Ng et al., 1997; Ogle and Roizman, 1999; Poon et al., 2000; Purves et al., 1993; Roizman and Knipe, 2001) 虽然由可观察到的结果可以得出UL13通过磷酸化ICP22,US1.5调节自身的功能,但在基因表达的领域UL13通过通过调节功能磷酸化ICP22与US1.5的直接连接还有待进一步证明70。UL13包装与被膜,一种定位于衣壳和外膜的结构组分。(Cunningham et al., 1992; Overton et al., 1992) 由此可以
48、得出UL13作为病毒组分的一部分,在磷酸化其他病毒蛋白的基础上起到一种维护病毒结构与可能性的角色。在新感染的细胞中壳皮蛋白逐渐释放进入细胞质15。因此,UL13的功能同样被期望于在早期感染后磷酸化病毒和细胞蛋白14。始终如一的是,据报道:在体内通过UL13磷酸化壳皮蛋白可以促进被膜的分解3。现今,关于UL13功能更多的报道产生于突变缺失株,其突变株具有蛋白激酶的缺陷性以及病毒组分活力的缺陷性27。为了研究UL13在感染细胞中的激酶活性,有些实验室生产出UL13的重组病毒通过用其他氨基酸取代赖氨酸残基,表达出UL13蛋白不具有蛋白质激酶的本质活性,担任具有UL13蛋白的特异结构29。其可以通过比
49、较UL13的缺失株以及野生病毒在细胞培养物中的表型,来揭示UL13所产生的唯一的催化活性5。此外,UL13蛋白激酶的在疱疹病毒中的保守性不得而知,但HSV-2 UL13的特异性性却不得而知17。如今,我们发现HSV-2 UL13作为一种磷蛋白可以自身磷酸化39。丝氨酸诱导的细胞外信号调节激酶和Cdc2基序对于自身磷酸化非常重要,但是磷酸化UL13磷酸化外源性底物却并不是很重要。HSV-2 UL13磷酸化的小肽同样能被ERK和Cdc2所识别。然而,Cdc2和ERK来说决定性底物残基的突变物并不能改变HSV-2 UL13磷酸化的多肽,同样HSV-2 UL13也不能磷酸化标准的Cdc2或者Erk多肽
50、底物64。通过HSV-2 UL13的磷酸化作用使得突变的脯氨酸围绕的肽磷酸化受体位点的减少,以及在小肽中所包含的丝氨酸,脯氨酸,丙氨酸,甘氨酸均可被磷酸化54。因此HSV-2 UL13并不能够模拟ERK以及Cdc2识别底物以及丝氨酸,脯氨酸的其最小识别基序80。这一基序很容易表明远侧序列或者是蛋白质的结构促成了HSV-2 UL13的底物特异性1。疱疹病毒家族被分成,三个亚科。HSV-1,HSV-2是大的双链DNA庖疹病毒21。他们之间具有83%的同源性以及核苷酸相同程度。HSV病毒粒子由衍生的脂质并镶嵌着糖蛋白组成的包膜构成,并由二十面体衣壳包围着基因组。在衣壳与包膜组成的被摸中,由一层由毒蛋
51、白组成的蛋白层24。壳皮蛋白中的一种就是丝氨酸,苏氨酸蛋白激酶UL13。在感染细胞后,壳皮蛋白首次在宿主细胞内部第一次被有效的使用26。因此,UL13能立即产生自身的效用作用于病毒与细胞的靶点,在被指定的疱疹病毒HSV-1,HSV-2中的UL13,疱疹病毒的UL97,人类的巨细胞病毒(HCMV),以及疱疹病毒的BGLF4, 爱泼斯坦巴尔病毒(EBV) 拥有与人类的,疱疹病毒UL13拥有同系器官。(Chee et al., 1989; McGeoch and Davison, 1986;Smith and Smith, 1989).HSV-1与HSV-2的UL13的类似体有的氨基酸序列的相似性达
52、到85%39。UL13广泛的保守性揭示出UL13在HSV复制循环中的重要角色48。UL13已经被提出具有两个功能:第一,UL13的活力被提及在病毒在进入新的被感染细胞时,通过磷酸化壳皮蛋白促进离解病毒的皮膜75。(Morrison et al., 1998) 第二,UL13激酶活力可以调节病毒基因表达:在一定的细胞系HSV-1 UL13缺失株的增长变得缓慢,可能由于UL13介导调节即刻早期蛋白ICP0以及一种亚群的晚期蛋白75。(Purves et al., 1993; Tanaka et al., 2005)UL13包含十一个标准的保守蛋白激酶子域,包括在子域II中的赖氨酸残基:直接通过AT
53、P互相影响,并且需要最适合的蛋白催化活性诱导催化。(Carrera et al., 1993; Hanks et al., 1988; Iyer et al., 2005; Smith and Smith, 1989)突变的赖氨酸显著的减少蛋白激酶的活性。(Iyer et al., 2005; Hanks et al., 1988; He et al., 1997; Kawaguchi et al., 2003; Kenyon et al., 2001)磷酸转移酶的激酶活力以及其自身结合的其他蛋白经常通过自身磷酸化作用或被其他激酶磷酸化来调节71。HSV-1 UL13和HCMV UL97在体外
54、自身磷酸化。(Baek et al., 2002a; Cunningham et al., 1992; Ogle et al., 1997) 一组研究者发现HCMV UL97的活力在于通过自身磷酸化之后磷酸化外源性的底物,另外一组研究者发现HCMV UL97的自身磷酸化与磷酸化的外源底物之间没有什么关系59。当HSV-2 UL13的自身磷酸化时的条件是否与HSV-1相仿,或者HSV-2 UL13蛋白激酶在体外时的活性并没有被调查研究54。UL13的底物可能性通过比较感染野生型以及UL-13缺损的HSV-1所得到的磷酸化的蛋白质已经被鉴定,或检查在体内的UL-13磷酸化蛋白31。与一些可观察到的
55、感染UL13 HSV-1的细胞相比,某些亚型的ICP22,ICP0,以及细胞蛋白EF-1和从细胞感染的HSV-1的RNA polII显示出了较低的电泳迁移率。(Purves and Roizman, 1992; Ogle et al., 1997; Ng et al., 1998; Long et al., 1999; Kawaguchi et al., 1998) HSV-2 UL13同样可以识别EF-1作为底物,然而HSV-2 UL13的缺陷病毒并不能产生用作阴性对照48。通过HSV-1 UL13磷酰化的gE, gI and ICP0同样被减少,因为在被野生型毒株感染的细胞中被重同位素32
56、-P标记的蛋白,比被UL-13缺陷型毒株明显增多。(Ogle et al., 1997; Ng et al., 1998) UL13自身也被标记在野生毒感染的细胞上。这一现象已经被提出通过UL13识别底物,但是另一些通过UL13激活的激酶已经被选择性的应用35。在体外激酶测定分析试验中,更多的决定性的经鉴定的蛋白都能作为UL13的底物45。在HSV的被膜中包含UL13,以及当在有32P-ATP ,Mg2+抚育时,分离出的HSV-1被膜中准备释放的VP22均为磷酸化所依赖的种类。(Morrison et al., 1998)磷酰化所释放的VP22均发生在丝氨酸残基上。在ATP与Mg2+存在的情况下,UL13缺失株的VP
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