当归超临界提取物对AOM-DSS诱导小鼠炎症相关性结直肠癌化学预防作用

1、当归超临界提取物对aom/dss诱导小鼠炎症 相关性结直肠癌化学预防作用摘要采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(aom/dss)诱导的雄性小鼠结肠癌模型，研究当归超临界 提取物对诱发小鼠结肠癌的化学预防作用，并探讨其可能的 作用机制。给予雄性balb/c小鼠单剂量皮下注射aom (10 mg kg-1), 1周以后，给予2%dss饮用7 d,诱导结直肠癌。分别按照15, 30, 60 mg - kg-1灌胃给予药物组当归超临界提取物至第17周。当归超临界提取物组肿瘤发生率、小鼠 的荷瘤数及荷瘤体积均低于aom/dss模型对照组。这可能与 当归超临界提取物能够显著降低aom/dss诱导的小鼠炎症相

2、关结直肠癌模型中pcna, cox-2, inos的表达有关。研究结 果表明，当归超临界提取物对aom/dss诱导的小鼠炎症相关 性结直肠癌的发生、发展有一定的干预作用，可进一步用于 人类结直肠癌的化学预防研究。关键词当归超临界提取物；结直肠癌；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸钠当归为伞形科植物当归angelica sinensis (oliv.)diels的干燥根，味甘平，性温，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。其脂溶性成分挥发油主要含藁本内酯、丁烯基苯駄等成分。当归挥发油在当归化学总成分比例仅为 0. 62%1左右,却具有丰富的化学成分和广泛的药理作用。 目前，国家药品标准的成方制剂中以当归

3、挥发油入药的品种 多达40余种。近年来研究发现，当归挥发油具有抗炎镇痛、 提高机体免疫功能，可以用于肿瘤的辅助治疗2。本课题 组前期研究发现，当归超临界提取物(sfe-as)能够通过增 加nrf2/are通路中nrf2的表达以及其下游的抗氧化酶和解 毒酶的表达，增加细胞抗氧化、抗炎作用，其可能具有一定 的癌症化学预防作用。本实验在前期研究的基础上，采用氧 化偶氮甲烷(azoxymethane, a0m) /葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, dss)诱发的结肠炎相关性癌症(colitis associated cancer, cac)动物模型，考察当归超临界提 取物对

4、炎症相关性结肠癌的化学预防作用，并测定小鼠结直 肠黏膜中pcna, cox-2, inos蛋白的表达。1材料1.1试剂及药材 氧化偶氮甲烷(a0m)购自美国sigma 公司；葡聚糖硫酸钠(dss,相对分子质量36 00050 000) 购自美国 mp 公司；pcna mouse mab, cox-2 rabbit mab 购 自美国 cell signaling technology 公司；nos2 (ct9) rabbit mab购自santa cruz公司；甘肃岷县当归(产品编 号121101),购自安国路路通中药饮片有限公司，经北京中 医药大学中药学院刘春生教授鉴定为伞形科植物当归a.

5、sinensis的干燥根。按照本课题组制备当归超临界提取物的工艺3,制备得当归超临界提取物，出油率为（1.41±0. 06） %,其中主要成分藁本内酯的质量分数为（42. 12±0. 75） %o1.2动物spf级balb/c雄性小鼠购自斯贝福（北京） 实验动物科技有限公司，动物合格证号scxkc京）2011-0004。 6周龄，体重1822 g,饲养于北京中医药大学动物实验中 心，高脂颗粒饲料喂养，自由饮水。正常饲养1周，以适应 环境，自第2周开始实验。饲养室保持良好通风，控制环境 温度（23±2）°c,湿度（50±10） %, 12 h循环

6、光照。2方法2.1分组及模型的建立 将40只balb/c雄性小鼠，在实 验开始时，按体重随机分为5组，每组8只，分别为a0m+dss 模型对照组、当归超临界提取物低、中、高剂量组（15, 30,60 mg - kg-1）.空白对照组。前4组腹腔注射a0m 10 mg - kg-11次，空白对照组腹腔注射等量的0.9%的nacl水 溶液，1周后给予前4组2%dss水溶液自由饮用7 d；从第3周开始，药物组分别按15, 30, 60 mg kg-1每天灌胃给予 当归超临界提取物溶液，对照组和模型组平行灌胃给予0. 1%的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）水溶液，直至 第17周。2. 2观察指

7、标和处理方法 实验过程中观察并记录小鼠 的营养状况、活动状况、毛发、食欲、大便性状等，每周称 量并记录其体重。至实验第17周结束实验，将小鼠禁食24 h 之后，眼眶取血，静置取上清，之后颈椎脱臼处死，剪开小 鼠腹腔，自盲肠末端将结直肠与小肠分离，直至肛门处，取 下整段结直肠，并沿肠管纵轴纵向剖开，用预冷的中性pbs 溶液清洗肠内容物。将冲洗干净的肠管黏膜面朝上平铺于大 平皿内，仔细观察记录无肿瘤发生以及发生数目、大小和位 置，计算肿瘤发生率。滤纸吸干结直肠上的pbs溶液，取结 肠组织约1 cm置于10%中性福尔马林溶液中固定24 h,常 规组织脱水，石蜡包埋，切片，he染色，由2名经验丰富的

8、病理医师阅片确诊。按who新分类将上皮内瘤变视为异型增 生的同义词，轻度和中度异型增生归入低级别上皮内瘤变(low-grade of intraepithelial neoplasia, lgin), 重 度异型增生和原位癌归入高级别上皮内瘤变(high-grade of intraepithelial neoplasia, hgin),异型增生细胞穿透黏 膜肌层进入黏膜下层为浸润性癌4 o2. 3结直肠黏膜pcna, c0x-2, inos蛋白表达的检测 每 组随机选取5个蜡块标本，免疫组化法检测pcna, cox-2, inos蛋白的表达，组织切片脱蜡至水，抗原热修复，放入 3%的过氧化氢

9、溶液中，室温孵育10 min,滴加封闭液，室温 孵育10 min,滴加按1 ： 200稀释的一抗，4工过夜。0. 01 mol l-1pbs洗2 minx3次。滴加聚合hrp标记抗羊igg (sv-0003), 37 °c孵育 30 min, pbs 冲洗，2 minx3 次。dab显色，镜下控制反应时间，蒸镭水洗涤。苏木素轻度复 染、脱水，透明，封片、观察。每张切片在高倍镜(20x10) 下随机选取5个视野，采用数码摄像(nikon e800多功能生 物显微镜)及图像分析软件(image-pro plus 6. 0)进行图 像采集及分析，比较各组阳性染色部位的平均吸光度 (ia/a

10、rea)o2. 4统计学方法 采用spss 16. 0统计学软件进行统计学分析。计量资料以土s表示，各组数值采 用单因素方差分析，组间均数差异采用lsd-t检验；计数资 料选用 x2 检验。p 7 chao w w, kuo y h, li w c , et al. the production of nitric oxide and prostaglandin e2 in peritoneal macrophages is inhibited by andrographis paniculata , angelica sinensis and morus alba ethyl aceta/t

11、e fractions j j ethnopharmacol, 2009, 122： 68.8 chao w w, hong y h, chen m l, et al. inhibitory effects of angelica sinensis ethyl acetate extract and major compounds on nf-kappab transactivation activity and lps-induced inflammationj j ethnopharmacol, 2010, 129： 244.9 wang j, du j r, wang y, et al.

12、 z-ligustilideattenuateslipopolysaccharide-inducedproinflammatory response via inhibiting nf-kappab pathway in primary rat microgliaj acta pharmacol sin, 2010, 31： 791.10 saw c l l, wu q, su z y, et al. effects of natural phytochemicals in angelica sinensis (danggui) on nrf2-mediated gene expression

13、 of phase ii drug metabolizing enzymes and anti-inflammationj biopharm drug dispos, 2013, 34 (6)： 303.chemo-preventive effect of angelica sinensis7 supercritical extracts onaom/dss-induced mouse colorectai carcinoma associated with inflammationan jing, li xiao-ning, zhao bo-chen, wang qiong, lan yi,

14、 wu qing*(beijing university of traditional medicine， beijing 100102, china)abstract to study the chemo-preventive effect of the supercritical extracts from angelica sinensis (sfe-as) on induced colorectal carcinoma in mice by using the aom/dss-induced male mice colorectal carcinoma model , and disc

15、uss its possible action mechanism. male balb/c mice were subcutaneously injected with single dose of azoxymethane (aom, 10mg kg-1 body weight) . one week later, they were given 2% dextian sodium sulfate (dss) in drinking water for 7 days to induce colorectal carcinoma each drug group was orally admi

16、nistered with supercritical extracts from angelica sinensis at 15,30,60 mg kg-1untilthe 17th week. the tumor incidenee rate of the sfe-as group, mice tumor-bearing quantity and tumor-bearing volume of the sfe-as group were lower than that of the aom/dss model control group, which may be related with the significant reduction of pcna, cox-2, inos in the aom/dss-induced mouse colorectal carcinoma model associated with inflammation by sfe-as. according to the results of this study , sfe-as showed an intervention effect in the incidence and development of aom/dss-induced mouse colorect