第三章 动植物细胞培养产酶

1、第一节 动植物细胞特点及酶的生物合成调节第二节 植物细胞培养产酶第三节 动物细胞培养产酶第三章第三章 动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶 第一节第一节 动植物细胞的特点动植物细胞的特点n一、概述n动物细胞n无细胞壁，容易贴壁n对营养要求严格（血清培养基）n对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）n植物细胞n有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱n营养要求较动物细胞简单n生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难n一、概述n植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较特征特征哺乳动物细胞哺乳动物细胞植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞生长形式生长形式悬浮、贴壁悬浮、贴壁悬浮悬浮悬浮悬浮营养要求营养要求很复

2、杂很复杂很复杂很复杂简单简单倍增时间倍增时间 (h55细胞分化细胞分化有有有限分化有限分化无无环境影响环境影响非常敏感非常敏感敏感敏感一般一般产物存在部位产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度产物浓度低低低低高高供氧需求供氧需求 (KLa)12520301001000产物种类产物种类疫苗、单抗、酶、疫苗、单抗、酶、生长因子、激素等生长因子、激素等天然色素、天然天然色素、天然有机化合物等有机化合物等抗生素、有机抗生素、有机小分子、酶等小分子、酶等一一、概述、概述n植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较n动物细胞、植物细胞和微生

3、物细胞可以用相同方式培养n动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长n植物细胞和动物细胞对剪切力敏感n植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同n动物细胞 蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）n植物细胞 色素、香精、天然产物（小分子）、酶一一、概述、概述二、动植物细胞中酶生物合成的调节二、动植物细胞中酶生物合成的调节n从基因到蛋白质n有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞n动植物细胞具有比微生物更多的调节方式n转录水平调节n翻译水平调节n激素、神经调节DNA RNA Protein Active Enzyme转录逆转录复制翻译？折叠二、动植物细胞中酶生物合成的调节二、动植物细

4、胞中酶生物合成的调节n细胞分化改变酶的生物合成 端粒（telomere）n端粒是真核生物染色体的末端结构n由富含 G、T 的 DNA 简单重复序列不断重复而成n人端粒序列：TTAGGGn保护真核生物染色体免遭破坏n牺牲自我，填补 DNA 复制后在5-端留下的空隙n端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短n端粒酶（telomerase） 催化端粒合成和延长n核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列n端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中n基因扩增加速酶的合成n通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程n细胞的一种应急方式n基因扩增可以由选择压力引

5、起n耐药性细胞的抗药性产生n例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增二、动植物细胞中酶生物合成的调节二、动植物细胞中酶生物合成的调节n动植物细胞中酶生物合成的调节n增强子促进酶的生物合成n增强子（modulator） 能高效增强或促进基因转录的一段DNA 序列n增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达n具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同二、动植物细胞中酶生物合成的调节二、动植物细胞中酶生物合成的调节n抗原诱导抗体酶的生物合成n抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体

6、可变区赋予催化特性的特殊抗体n修饰法n在抗体与抗原结合部位引进催化基团n诱导法（主要方法）n半抗原诱导n酶蛋白诱导二、动植物细胞中酶生物合成的调节二、动植物细胞中酶生物合成的调节第二第二节节 植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶一、植物细胞及其一、植物细胞及其培养培养特点特点二、植物细胞培养的工艺流程二、植物细胞培养的工艺流程n1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想n植物细胞的全能性一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点产酶植物细胞产酶品种胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞-半乳糖苷酶甜菜细胞过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶

7、花生细胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞漆酶利马豆细胞-葡萄糖苷酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞结构一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞的主要特点n体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大n细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长n营养要求较动物细胞简单n细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件n对剪切力较敏感n主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞

8、培养的优势n提高目标物的产率n缩短生产周期n木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1个月n易于管理，不受自然因素控制n可以提高产物质量n通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n缺点n培养条件要求高 光照、剪切力影响显著n植物细胞生长缓慢 相对于微生物一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物体外培养n胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞培养 外植体选择和处理n外植体（explant）n从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的

9、植物组织片段或小块n根、茎、叶、芽、花、果实、种子等n选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则n切片：0.51 cmn消毒n70% 乙醇n5% 次氯酸钠 / 10% 漂白粉n0.010.1% HgCl2一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点动 植 物 细 胞 培 养 产 酶n植物细胞培养产酶n植物细胞培养 获取植物细胞：直接分离法n直接分离法即直接从外植体中分离n机械法n将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞n质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少n酶解法n利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞n能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护n植物细胞培养产酶n植物细胞培养 获取植

10、物细胞：愈伤组织诱导法n愈伤组织（callus）n由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织n诱导过程n配制半固体诱导培养基n灭菌、植入外植体n13周后继代培养一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞培养 获取植物细胞：原生质体再生法n一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物n保持溶液的高渗状态n防止原生质体胀裂n渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等n原生质体培养，再生细胞壁一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞

11、培养 悬浮培养n将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法n悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜n植物细胞培养 产物分离纯化n收集培养液，从中获得所需的产物一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n植物细胞培养产酶n植物细胞培养基n水：一般用去离子水或蒸馏水n无机成分n大量元素：N、P、K、Ca、Mg、Sn微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Con有机成分n碳源：糖，以蔗糖最常用n氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、无机氮n维生素：主要是B族维生素和维生素Cn生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）n其他：肌

12、醇、琼脂等一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点常用的植物细胞培养基nMS 培养基n硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广nB5 培养基nNH4+ 浓度较低，适用于双子叶木本植物nWhite 培养基n无机盐浓度低，高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养nKM-8P 培养基n有机成分种类齐全，用于原生质体培养一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n培养基配制n配制母液，使用时按需要稀释一、植物细胞及其培养特点一、植物细胞及其培养特点n温度n室温范围（25 oC左右）n最适产酶温度和最适生长温度不同npHn微酸性（pH 56）n细胞培养时，pH一般变化不大n溶解氧n植物

13、细胞需氧量不高，供氧不宜过量n对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈二、植物细胞培养的工艺流程二、植物细胞培养的工艺流程n光照n光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）n光照有时也抑制产物合成n添加前体n前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质n添加前体相对于添加了反应的底物n刺激剂（elector）n引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成n常用微生物细胞壁碎片和胞外酶二、植物细胞培养的工艺流程二、植物细胞培养的工艺流程n植物细胞培养产酶n产酶实例 大蒜细胞培养产 SODn超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC 1.15.1.1）n生物体

14、内清除超氧化物阴离子自由基（O2-）的重要金属酶类nSOD 和过氧化氢酶 (catalase)、过氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应三、植物细胞培养产酶实例三、植物细胞培养产酶实例n产酶实例 大蒜细胞培养产 SODn大蒜愈伤组织的诱导n选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮n先用70% 乙醇消毒 20 s，再用0.1%升汞消毒 10 min，然后无菌水漂洗3次n在无菌条件下，切成0.5 cm3 的小块，植入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的半固体 MS 培养基中n25

15、 oC，600 lux，12 h/d光照条件下培养18天，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次三、植物细胞培养产酶实例三、植物细胞培养产酶实例n产酶实例 大蒜细胞培养产 SODn大蒜细胞悬浮培养n将上述在半固体 MS 培养基上培养18天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养1012天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞n无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的液体 MS 培养基中，25

16、 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养18天nSOD 分离纯化n收集细胞，破碎，用pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取三、植物细胞培养产酶实例三、植物细胞培养产酶实例n第三节第三节 动物细胞培养产酶动物细胞培养产酶n一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n二、动物细胞培养的工艺流程二、动物细胞培养的工艺流程n三、动物细胞培养产酶实例三、动物细胞培养产酶实例n1907年，Harrison 开创了动物组织培养的先河n从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维n1950s，Earle 用动物细胞培养制取病毒

17、疫苗n1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发n1975年，杂交瘤技术n动物细胞可产生较高价值的物质n激素、疫苗、单克隆抗体、酶一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养产酶n动物细胞结构一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞特性动物细胞特性n没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）n体积比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞n在肌体内相互粘连，以群体形式存在n在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性n营养要求复杂（血清培养基）一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养的特点n主要用于生产蛋白质n生长缓慢n容易受污染（

18、细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素n对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）n大部分具有贴壁依赖性 贴壁培养n培养基成分复杂，价格高昂n细胞生命有限，一般最多继代培养50代即退化死亡一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养方式动物细胞培养方式 悬浮培养悬浮培养n适用于非贴壁依赖型细胞n杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞n类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别n对通气、搅拌耐受性差n对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例 CO2一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养方式动物细胞培养方式 悬浮培悬浮培养养n优点优点（相对于贴

19、壁培养）n细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好n传代培养容易，无需消化分散细胞n培养基中营养成分利用率高一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养方式 贴壁培养n适用于贴壁依赖型细胞n上皮细胞、成纤维细胞n细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂n滚瓶培养系统n结构简单，但比表面积小n微载体培养系统n由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球n兼具单层培养和悬浮培养的优势n细胞生长环境均一一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养方式 固定化培养n贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用n吸附法n载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒n贴壁型细胞的微载体培养即属此类n包埋法n将

20、细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中n细胞不易脱落n固定化培养优点n细胞损伤程度低，可重复使用n产物分离容易一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养产酶n动物细胞培养过程n种质细胞n体细胞（动物体内组织取出）n杂交瘤细胞n基本工艺过程一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n动物细胞培养基n氨基酸：各种必需氨基酸，Gln 等，作为碳源和能源利用n维生素：B族和维C，可由血清提供n无机盐：调节渗透压n微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供n葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）n激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松等，可由血清提供n生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点n培养基配制n配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln 单独配制，冷冻保存一、动物细胞及其培养特点一、动物细胞及其培养特点二、动物细胞培养的工艺流程二、动物细胞培养的工艺流程n温度n哺乳动物细胞培养一般控制在 36.50.25 oCn温度也影响 CO2 溶解度，从而影响培养液 pH 值n