复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清IL-13的作用

1、复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清il-13的作用崔素华1、2 丁伯平1黄维琳2唐国华3 ( 1皖南医学院药理教研室安徽芜 湖241000)(2安徽中医药高等专科学校安徽芜湖24 1000)(3芜湖市第 一人民医院安徽芜湖241000 )【摘要】目的探讨复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清白细胞介素-13cil-13)的作用， 从分子水平研究其治疗哮喘的可能机制。方法 釆用卵白蛋白腹腔注射致敏建立 小鼠支气管哮喘模型，用复方地龙胶囊、地塞米松与牛理盐水对小鼠进行干预， 用酶联免疫吸附法(elisa)检测小鼠血清白细胞介素(i l-13)的表达水平。 结果 哮喘模型组小鼠血清ilj3含量显著高于正常对照组(p&a

2、mp;lt;0.01);复方地 龙胶囊各剂量组及地塞米松组ilj3含量水平均明显低于哮喘模型组(p<0.05)； 复方地龙胶囊各剂量组与地塞米松组比较，差异不显著(p>0.05)o结论复方 地龙胶囊可能通过影响哮喘小鼠血清il-13的水平，调节免疫系统产牛治疗作用。【关键词】复方地龙胶囊 哮喘il-13支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎性细胞和结构细胞(如嗜酸粒细 胞、肥大细胞、t淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)和细 胞组分参与的气道慢性炎症性疾病1。流行病学研究表明，哮喘的发病率和病 死率具有全球性上升的趋势2。据世界卫生组织估计，全球大约有3亿

3、哮喘患 者。防治哮喘己成为全球公共卫牛问题。哮喘的主要特征是气道嗜酸性粒细胞浸润、支气管痉挛和气道高反应。 免疫反应在哮喘的发病机制中占有重要地位。根据细胞因子分泌及效应功能的不 同，抗原特异性cd4+t细胞分为1型辅助性t淋巴细胞(thl)和2型辅助性t 淋巴细胞(th2)两类。现研究认为哮喘发病的重要基础是thl / th2细胞类细胞 因子比例和功能失衡3。thl和th2细胞之间处于相互抑制状态，两者形成复杂 有序的细胞因子网络，调节正常的免疫应答。正常情况下，两者处于一种平衡状 态。th细胞中的thl/th2平衡失调，t h2细胞数目增多及功能亢进是哮喘发 病的重要基础之一4。哮喘时浸润

4、至气道的主要为th2细胞,t hl细胞相对较少； 由t h2细胞所产生的th2类细胞因子i l5、il-13等在哮喘气道表达的mr n a及 蛋白水平均过度增高;th i类细胞因子如i fn-r相对不足o ifn-r和i l5、il-13 分别是th i和th2免疫反应的代表性细胞因子，体现着th i和t h2细胞的主要 生物学效应。"2类细胞因子11_5、il-13等产生增多，而thl类细胞因子ifnr 等产生减少，从而导致b细胞合成增多、嗜酸性粒细胞活化浸润气道及气道高反 应性。因此调节thl/th2平衡对哮喘的治疗具有重要意义，促进tho细胞向t h i细胞分化，抑制th2型细

5、胞因子的产生，调节thl / th2的反应失衡可能用于防 治哮喘。由于th2细胞因子在哮喘等过敏性炎症的发生发展中起的重要作用，以 此为靶点的研究是目前哮喘治疗研究中的热点5-8 o1材料与方法1.1实验对象48只清洁级健康小鼠，体重30±2g,雌雄各半，购自南京青龙 山实验动物中心。1.2主要仪器全自动电子雾化器（南京道芬电子仪器厂），802型离心机（上海手术 机械厂），微量移液器（上海求精玻璃仪器厂），电热恒温水箱（上海医用恒温设 备厂），酶标仪（美国costar公司）。1.3主要试剂卵白蛋白（合肥博美生物科技有限责任公司）、复方地龙胶囊（南京恒 生制药厂,批号:z1

6、99991007）小鼠白细胞介素13定量检测试剂盒（elisa）（深 圳晶美生物公司）。1.4动物分组48只小鼠随机分为6组，每组8只。a组为空白对照组，b组为哮喘模 型组，c组为复方地龙胶囊高剂量组（0.9mg/g/d）, d组为复方地龙胶囊中剂量组 （0.6mg/g/d）, e组为复方地龙胶囊低剂量组（0.3mg/g/d）, f组为地塞米松激素治 疗组（1.5mg/kg/d）o1.5建立模型采用鸡卵清蛋白(ova)腹腔注射及雾化吸入方法制造小鼠哮喘模型。 小鼠适应性饲养一周，空白对照组以生理盐水致敏和引喘，其余各组于dl、8 天分别腹腔注射含10%ova100ug.明矶2m g混悬液0.3

7、ml致敏，两周后小鼠 逐个放入体积约5l的透明密闭容器中，雾化吸入1%ova (200mgova溶于生理 盐水20 ml ) 20分钟，连续7天，小鼠出现明显腹肌收缩、鼻部潮湿、喷嚏、 紫纟甘、烦躁、激惹等呼吸道症状，证明激发成功。1.6治疗方法空白对照组、哮喘模型组在每次激发前lh以生理盐水灌胃，地塞米松 组在每次激发前lh腹腔注射1.5m g/kg地塞米松注射液，复方地龙胶囊高、中、 低剂量组在每次激发前lh分别予小鼠复方地龙胶囊0.9mg/g> 0.6mg/g、0.3mg/g 灌胃。1.7标本获取全部动物于末次激发后lh,眼眶动脉取血牛5ml。所取血液在4°c, 4000

8、r/min离心30min,留置血清于低温冰箱中备用。1.8 elisa 流程(1) 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。(2)配液：用 蒸憾水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。(3)加标准品和代测样本：取 足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白 对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50µ i；待测样本孔先加 入待测样本10µl,再加样本稀释液40µ i. (4)温育。(5)洗板。(6) 加酶标工作液。(7)温育。(8)洗板。(9)显色。(10)终止。(11)测定。(12) 计算：根

9、据标准品的浓度及对应的od值，计算出标准曲线的直线回归方程，再 根据样本的od值，在冋归方程上计算出对应的样品浓度。最终浓度为实际测定 浓度乘以稀释倍数。1.9统计学处理各指标(记量资料)均以表示，运用spss13.0统计软件进行单因索方差分析及直线相关分析，组间差异比较用t检验，设定p<0.05为有显著性差异。2结果2.1复方地龙胶囊对哮喘小鼠血清il-13的影响哮喘模型组小鼠血清|l13含量显著高于正常对照组(p<0.01)；复方 地龙胶囊高、中、低剂量组及地塞米松组i l-13含量水平均明显低于哮喘模型组， 差异有显著性(p<0.05)；复方地龙

10、胶囊高、中、低剂量组与地塞米松组比较， 差异没有显著性(p&gt；0.05)(见表)。表1不同组别小鼠血清il13的表达(n=8,x&plusmn;s)与正常对照组比较:* p<0.01；与复方地龙胶囊中剂量组比较:apv0.05；与哮喘模型组比较：p<0.05 p<0.013讨论哮喘是一种气道慢性炎症性疾病'以气道嗜酸性粒细胞浸润、支气管痉 挛和气道高反应为主要特征。现代医学认为，th2优势分化及其所产生的细胞因 子在哮喘的发病过程中起到关键性调节作用。现代医学对哮喘的治疗仍然首选糖皮质激素全身或局部用药，但长期应 用副作用明显。中医药重视整体调节，

11、治疗本病有潜在优势。地龙是柜蚓科动物 参环毛蚓或编蚯蚓的干燥体，性味咸寒，能清热、熄风、平喘、通络、利尿，是 一味用途广泛的中药。本草纲目指出：“其性寒而下行，性寒故能解诸热疾, 下行故能利小便，治足疾而通经络也。”在治疗哮喘方面，地龙有较强的药理效 应，其平喘作用与其抗炎、抗组胺和解痉作用有关。目前世界各国对地龙的 研究日益深入和广泛，另外地龙资源丰富，提取成本低廉，提取物毒副作用低, 疗效显著10o复方地龙胶囊是由地龙、川穹、黄茂和牛膝等组成的中药三类新 药。其处方由清王清任医林改错中的补阳还五汤化裁而来llo本研究发现，复方地龙胶囊能抑制哮喘小鼠肺组织中il13的表达，明 显抑制了小鼠的

12、炎症和肺部eos浸润。本研究相关分析表明，肺组织中il13 的表达与白细胞计数和eos计数密切相关，提示复方地龙胶囊治疗哮喘可能是 通过抑制哮喘小鼠中i l-13而实现，复方地龙胶囊抑制小鼠气道炎症及i l-13的 效果与地塞米松比较无明显差异，且无激素类似的副作用，表明复方地龙胶囊在 哮喘的治疗方面有进一步开发应用的价值。参考文献中华医学会呼吸病学分会哮喘学组支气管哮喘防治指南j 中华结核和呼吸杂 志，2008, 31 (3)： 177-185.2 bramanss.the global burden of asthmaj.chest,2006,130:4-12.3 herrick ca,b

13、ottomly k.to respond or not to respond:t cells in allergicasthmaj.nat rev lmmunol2003,3:405-412.4 蒋玉红，王亚秋，孙宽秋.支气管哮喘患者th细胞的极化状态及临床意义j 中国当代儿科杂志，2006, 8： 379-381.5 nakamura hoshi no m th2 cytoki nes and associated tran scripti on factors as therapeutic targets in asthma j. curr drug targetsinflammallergy,2005,4(2):267-270.6 0&rsquo;byr ne pm. cytoki nes or their an tag on ists for the treatme nt of asthmaj.chest,2006,130(1):244-2507 yamagata x ichinose m. agents against cytokines synthesis or receptorsj. eurj pharmacol,2006,553:289-301.8 ngoc pl, gold dr, tzianabos ao, et al cyt