高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型探究

1、高氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型探【摘要】目的：探讨用c57bl小鼠建立高氧诱导的 早产儿视网膜病变（rop）动物模型，为研究该病的发病机 制及治疗提供成熟的研究对象。方法：鼠龄为7天的新生 c57bl小鼠随机分组，每组20只小鼠，将实验组小鼠置于密 闭氧仓中饲养，氧仓连接氧浓度测量仪，保持氧箱内氧浓度 为75±2%, 5天后将小鼠取出置于常氧环境中饲养。对照组 小鼠置于普通空气中饲养。两组小鼠均在出生后17天将小 鼠处死，行眼球病理切片he染色、视网膜新生血管细胞核 计数及apd染色视网膜铺片，了解视网膜新生血管的形成情 况。结果：正常对照组小鼠的视网膜组织切片中，内界膜清 晰、

2、连续，突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核极少，平均 每张切片中为1.2±0. 75个。实验组鼠视网膜组织切片中显 示视网膜表面高低不平，较多突破内界膜的血管内皮细胞 核，平均每张切片中新生血管内皮细胞核数为34. 58±6. 15 个，与对照组相比，差异有非常显著的统计学意义。在视网 膜铺片中对照组的视网膜血管发育成熟，自视盘发出向周边 呈放射状均匀分布，血管形态及管径正常，分支血管发育良 好。实验组可见视网膜血管迂曲变细，分布紊乱、周边大量 无灌注区及新生血管芽形成。结论：高氧诱导的小鼠可成功 形成视网膜新生血管，可以作为早产儿视网膜病变研究的成 熟动物模型。【关键词】高氧

3、，早产儿视网膜病变，视网膜新生血 管，动物模型【中图分类号ir774.1【文献标识码】a【文章编号】 1004-7484 (2012) 12-0023-02早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, r0p)是指新生儿视网膜血管异常增殖所致的一类疾病，是 导致新生儿失明的最重要原因。1, 2目前，该病的发病机 制仍不明确。目前国内外对于r0p的最佳治疗仍局限于对阈 值或阈值前病变进行光凝或冷凝，尽管如此仍有10%15% 的重症患儿最终失明3, 4。因此，深入研究r0p的病理变 化和发病机制，并采取有效措施阻断这一关键步骤，必将有 利于r0p的治疗，对提高早产儿生存

4、质量具有重要和实际的 意义。同时在r0p的研究中选择一种合适的动物模型是r0p 研究的重要实验基础。1994年smith等设计的小鼠氧诱导视 网膜病模型方法简单，可行性好，成功率高，因此该动物模 型在r0p研究中得到了广泛的应用。本研究在此基础上，建 立了氧诱导下的简单实用的r0p小鼠模型，以便进一步研究 r0p的发病机制及研究其干预手段。1实验动物和方法1. 1实验动物健康c57bl/6j小鼠40只，鼠龄为7天，性别不限，与 母鼠共同饲养，系清洁级动物。将无毒透明塑料箱的两端打 孔，一端连接氧气，另一端连接测氧仪，两端连接处及箱盖 与箱体连接处使用胶带封闭，塑料箱底铺石灰颗粒与木屑， 保持容

5、器内干燥。1.2实验方法1.2. 1动物模型的建立和分组将其分为两组：高氧组正常对照组，每组幼鼠数量为20只，雌雄不限。高氧 组的c57bl/j6小鼠出生后第七天，将实验幼鼠及哺乳母鼠 放于塑料箱中暴露于75%氧气共5天，出生后第12天将小鼠 转入正常空气房间。至出生后17天将小鼠处死，行眼球病 理切片及视网膜铺片。1. 2. 2病理标本制作及视网膜新生血管细胞核计数 小鼠眼球常规于眼球甲醛固定液中固定，固定48小时候，梯 度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，做一系列连续 切片，厚度4-6微米，任意选取不包括视乳头的20张病理 切片，在低倍镜下统计平均每张眼球切片突破视网膜内界膜 而长入玻

6、璃体内的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞细 胞核时仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞细胞核。1.2.3adp酶组织化学法染色的视网膜铺片小鼠处死后摘出眼球，置于10%福尔马林中12小时，在解剖显微镜下 除去角膜、晶状体、脉络膜及巩膜。用毛笔扫除玻璃体以及视网膜外层的色素上皮，将游离视网膜以视乳头为中心放射 状对称剪为4瓣，自来水冲洗12小时，在371水浴箱中 用3%胰蛋白酶消化7小时，行adp酶组织化学法染色，封 片后行光学显微镜观察结果并照相。1.2.4统计学分析 所有数据以统计分析软件spss16. 0 进行分析，数据以均数土标准差（x±s）表示，采用两组 独立样本t检验分析方

7、法比较各组突破视网膜内界膜的血管 内皮细胞核数目。以pw0.05为差异有显著性统计学意义。2结果 2.1两组视网膜血管形态的改变正常对照组的视网膜铺片中，视网膜血管基本成熟，视网膜血管自视盘发出，向 周边呈放射状均匀分布，血管走行直，分支较少且结构清晰,周边部视网膜血管网结构清晰，可见到少量无灌注区。视网膜血管可见分深浅两层。浅层血管呈放射状分支分布，深层血管呈多角形网状形态，两层血管网状结构通过螺旋形的交通动脉互相连接。高氧组可见视盘发出的大血管管径变细,分支减少，走行僵直，视网膜中央可见大片无灌注区，视网 膜血管丧失了正常的放射状结构，有大量的视网膜新生血 管，血管分布紊乱、走行迂曲，周边

8、部血管密度增高，且浅 层血管网及大部分深层血管网广泛闭塞。可见血管渗漏现 象。两组的视网膜血管形态有很大的不同。2.2视网膜血管内皮细胞核计数 正常对照组鼠龄为17 天的视网膜组织切片中，内界膜清晰、连续，未发现或仅在 少数切片中见到视网膜内界膜附近玻璃体内的血管内皮细 胞核，平均每张切片中为1.2±0. 75个。高氧组鼠视网膜组 织切片中显示视网膜表面高低不平，神经节细胞层与神经纤 维层出现大量新生血管，可见到较多突破内界膜的血管内皮 细胞核，单独或成簇出现，有些甚至形成毛细血管腔，平均 每张切片中新生血管内皮细胞核数为34. 58±6. 15个，与正 常对照组相比，差异

9、有非常显著的统计学意义（p 为 探究rop的发病机制和治疗方法，建立具有相似的典型病理 特征并且重复性高的动物模型是保证后期研究工作结果客 观可靠的前提条件。目前，国内外也有许多实验通过制作rop 鼠模型对rop的治疗进行研究。penn等7将新生鼠放在不 同的氧环境中，制作视网膜新生血管的模型，以期通过类固 醇达到治疗rop的目的。rabinowitz等8用43例野生型幼 鼠进行研究，实验组出生后5天接触750ml/l的氧气，随后 5天接触室内空气（相对缺氧），对照组从出生一直接触室内 空气，从而制作出rop动物模型。1994年smith等9将7 日龄的c57bl/6j小鼠先置于75%氧浓度中

10、饲养5天，然后在 空气中继续饲养，通过低分子右旋糖肝荧光素灌注法观察视 网膜血管形态，以眼球病理切片中玻璃体腔内新生血管的内 皮细胞核数目来定量分析新生血管程度，结果100%的小鼠在 17日龄和21日龄之间出现了视网膜新生血管，从而建立了 重复性好、可定量研究的氧诱导视网膜病变小鼠模型。鼠类 生理性视网膜血管发育在出生后2周，新生小鼠的视网膜血 管发育程度相当于孕龄为45个月的早产儿，小鼠出生后 7天视网膜发育尚不完全，移至高氧环境中血管发生痉挛、 闭塞，形成无灌注区，移至常氧条件后无灌注区发生缺血缺 氧，产生新生血管，17至21天后视网膜新生血管达到高 峰，因此是一种成熟可靠的动物模型。基于

11、上述特性，我们 选择遗传背景一致的近交系c57bl/6j小鼠，在其出生后7 天放置于高氧环境中，此时是小鼠的玻璃体血管基本退行， 而视网膜血管发育尚未成熟，因此相对缺氧剌激后的血管增 生性反应主要为视网膜血管的增生，这样可以最大限度的减 少计算视网膜血管增生时的误差。动物模型成功的主要因素 在于氧气浓度的稳定及持续，氧浓度过高实验动物死亡率将 上升，氧浓度过低，实验动物的视网膜新生血管形成机率将 减少，不利于rop模型的建立。另外，饲养箱中保持干燥密 闭，避免嘈杂，对实验动物的存活率有一定的影响。我们的 实验证实，经高氧诱导后的小鼠视网膜新生血管成功建立， 从视网膜铺片中可以清楚了解视网膜血管

12、的形态和分布，组 织切片也表明高氧组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核 数远高于对照组，导致新生血管长入玻璃体，最终引起早产 儿视网膜病变。本研究中我们通过高氧诱导小鼠视网膜产生新生血管， 其发育的生理过程与早产胎儿相似，产生了类似于rop病变 的表现，为进一步研究rop的发病机制和治疗奠定了实验基 础，通过此方法可以得到存活率高，稳定性及重复性好的rop 实验动物模型。参考文献：1 唐松 张国明黄丽娜等。1区急进性早产儿视网膜 病变的临床特征及治疗。中华眼底病杂志，2008； 24 (1)： 58-59 页2 rekha s, battu rr. retinopathy of prematur

13、ity：incidence and risk factors indian j pediatr, 1996, 33：999-1003.3 黄丽娜，张国明，吴本清早产儿视网膜病变广州: 广东科技出版社，2007.4 张国明，曾键，黄丽娜，等深圳早产儿视网膜病变筛查结果分析.中华眼底病杂志，2008；24 (1)：38-40.5 北京早产儿视网膜病变流行病学调查组北京早产儿视网膜病变筛查和高危因素分析.中华眼底病杂志， 2008；24 (1)：30-34.6 罗亮，唐松，吴本清，等。早产儿视网膜病变筛查情况分析。实用医学杂志，2008 (14)：2479-24817 penn js, rajara

14、tnam vs, collier rj, et al. the effect of an angiostatic steroid on neovascularization in a rat model of retinopathy of prematurity. ivest ophthalmol vis sci 2001； 42 (1)： 283-2908 rabinowitz r, kate g, rosner m, er al the effect of thalidomide on neovascularization in a mouse model of retinopathy of prematurity .graefes a