三种主要酶活测定方法

1、土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.

2、2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液.4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物

3、现象，则应弃之，重新配制。三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37恒温箱中培养72h。培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的

4、蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。纤维素酶活性=（a样品a无土a无基质）×nma样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m表示烘干土重木聚糖酶活性测定方法一、方法原理 样品的木聚糖酶对底物燕麦木聚糖进行水解，用DNS（3，5二硝基水杨酸）试剂分光光度法测定水解所产生的还原糖量。二、活性单位定义 在温度为50，pH 5.3条件下，1s内从燕麦木聚糖中产生1nmol木糖所需的酶量，

5、为1个木聚糖酶的活性单位（BXU）。三、应用范围 本法用于来源于曲霉属（Aspergilious）或木霉属（Trichoderma）的木聚糖酶样品的测定。当分析其它来源的酶时，该法的线性需要校正。本法适用于各种含有木聚糖酶的产品。四、测定条件4.1 底物：燕麦木聚糖4.2 pH： 5.34.3 温度：50±0.54.4 保温时间： 5min 五、仪器5.1 超级恒温水浴锅：505.2 水浴锅： 1005.3 旋涡磁力搅拌器5.4 分光光度计：可在540nm下测定吸光度5.5 分析天平：感量0.0001g六、试剂所有试剂溶液均需用去离子水配制。6.1 柠檬酸缓冲液（0.05mol/l、

6、pH5.3） 溶解10.5g柠檬酸（C6H8O7H2O）于800ml水中，并用1mol/L氢氧化钠调pH至5.3，（消耗约110ml 1mol/L氢氧化钠），再用水定容至1000ml。6.2 底物1%燕麦木聚糖 称取1.0g燕麦木聚糖，溶于80ml 60柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。用柠檬酸缓冲液定容至100ml。此底物溶液在4时最多保存一周，或将底物溶液分成等份在-20下冰冻保存，临用前融解，搅拌均匀使用。6.3 DNS试剂 溶解50.0g 3，5二硝基水杨酸于4000ml水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0g氢氧化钠，使之完全溶解，在继续磁力搅拌

7、下，将1500g酒石酸钾钠分数次少量加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45。冷却至室温后定容至5000ml。如溶液不澄清，用Wheatman1号滤纸过滤，然后室温保存于深色瓶中。七、样品制备 精确称取样品1.0000g，置于研钵内，加入5ml的柠檬酸缓冲液，研磨片刻，放置30min后，用柠檬酸缓冲液稀释受检样品。调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.100.40之间。八、测定步骤8.1 试样测定 分别向2支试管加入1.8ml底物溶液，置50水浴保温5min。在其中1支试管中加入200l稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置50水浴中，准确保温5min。分别加入3.0ml DNS试剂至2支试管中，搅拌

8、均匀。在另一试管（空白管）中加入200l缓冲液。同时将2支试管置入沸水浴准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。在540nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。继续做2个重复测定。8.2 标准曲线的制定8.2.1 配制10mol/ml木糖储备液 将150mg木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，并用柠檬酸缓冲液定容至100ml。储备液可分成小量在-20下冰冻。使用前，融解并混合均匀。8.2.2 配制标准稀释液 用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：稀释比例 木糖(mol/ml) 酶活(BXU/ml)1+0 10.0 33.331+1 5.0 16.671+2 3.3

9、3 11.111+4 2.0 6.678.2.3 制备标准曲线 每种标准稀释液做2次重复测定。分别向2支试管中加入1.8ml底物溶液，50水浴保温5min。加入3.0mlDNS试剂和200l标准稀释液，在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。以200l柠檬酸缓冲液代替标准稀释液配制试剂空白。每批样品制备一次标准曲线。九、测定结果的计算 木聚糖酶活性(BXU/g) = （木糖浓度*1000*稀释倍数）/（样品重量*反应时间300S）土壤磷酸酶活性测定（磷酸苯二钠比色法）一、原理测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机

10、基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：45、67、810。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.05.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.08.5）、和硼酸缓冲液（PH910）。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、-或者-萘酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。二、试剂1）缓冲液：（1）醋酸盐缓冲液（PH 5.0）0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸

11、溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至1L.（2）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.0）0.1mol/L 柠檬酸溶液 19.2g C6H7O8溶至1L.0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 53.63g Na2HPO4.7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L.取6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至100ml.（3）硼酸盐缓冲液（PH 9.6）0.05mol/L 硼

12、砂溶液 19.05g 硼砂溶至1L.0.2mol/L NaOH溶液 8g NaOH溶至1L.取50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀释至200ml.2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10ml 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸铝溶液6）酚标准溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液稀释至1L。三、操作步骤称5g土样置于200ml三角瓶中

13、，加2.5ml甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用乙酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，37下培养24h。然后在培养液加入100ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，于分光光度计上660nm处比色。标准曲线绘制：取0、1、3、5、7、9、11、13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后，在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项:1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解。3、如果样品