项目名称：生物医学纳米材料对血细胞作用的研究首席科学家：

1、项目名称：生物医学纳米材料对血细胞作用的研究首席科学家：顾宁 东南大学苏州研究院起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部 江苏省科技厅二、预期目标总体目标：本项目以血液恶性肿瘤的早期诊断、有效治疗和疗效评价的重大临床需求为目标，通过研究纳米材料对血细胞的作用，将纳米生物医学技术与血液恶性肿瘤诊治相结合，力争在血液恶性肿瘤的发病机制和病理学研究、早期检测与诊断、临床干预与治疗方面取得具有重大国际影响力的原创性重要成果，建立和发展全新的血液恶性肿瘤诊治策略和方法，培养能够进行原创性研究的交叉学科人才，使我国在生物医学纳米材料及其在血液恶性肿瘤诊治的应用研究这一领域进入国际先进行列，为人

2、类健康事业做出贡献。五年预期目标：通过五年的努力，实现以下目标：1基于纳米材料对白血病细胞的作用，发展有效的纳米基因载体，在白血病细胞中得到转基因的高表达；明确若干白血病致病基因；2研制出具有特异性生物识别和示踪功能的光学、磁学及电化学生物纳米探针及其标记白血病细胞的方法；阐明中枢神经系统白血病形成机制的一般规律，以及白血病细胞穿越血脑屏障的调节分子。为白血病的诊治提供实验和理论基础。3揭示纳米探针对血液细胞的生物学作用，建立和完善血液细胞实时动态监测的技术平台；构建血液恶性肿瘤快速和分型诊断的微芯片纳米技术平台。4建立纳米探针与显微医学影像创新科技平台；研制出纳米材料标准样品和具有自主知识产

3、权的高性能纳米探针，建立高特异、高灵敏、高分辨、动态实时的血液恶性肿瘤分子影像学诊断与疗效评价新方法。5阐明纳米粒子对血液中免疫功能细胞的作用机理、调控免疫效应的信号传导通路和机制；6确立13种提升抗白血病免疫反应的纳米材料，建立相关应用技术流程和方法，建立针对T淋巴细胞性白血病的纳米免疫治疗方法。通过上述目标的实现，促进我国纳米生物医学与生物医学工程等学科的发展，在交叉学科的前沿基础研究方面做出独创性成果。发表135篇左右具有高影响力的研究论文，申请20个左右相关发明专利，为我国的纳米生物医学领域培养一批科研人才，培养研究生80100名，博士后812名。进一步发展和壮大科研团队，培养和稳定一

4、支创新、合作、结构合理、特色鲜明的高层次研究队伍。三、研究方案一、在纳米材料与白细胞的作用及其在白血病发病机制和病理学的研究方面，重点围绕中枢神经系统白血病形成机理和急性髓系白血病相关基因的筛选和致病机理来进行。具体路线如下：1. 优化针对血液细胞的基于纳米材料/技术的基因递送方法1.1 选择不同的纳米材料（如无机碳酸磷灰石纳米颗粒、磁性纳米颗粒，或进行一定的表面修饰）搭载报告基因（比如GFP）转染不同的细胞以确定适合各种细胞的纳米材料；改变转染中的各种条件（包括含有GFP的DNA片段的长度，纳米材料与DNA片段的比例等）以优化转染方法；使用流式细胞仪检测GFP+的细胞以确定转染的效率，以及基

5、因表达的时间和强度等。1.2 选购或构建shRNA及cDNA文库和合适的纳米材料，建立使用纳米材料递送基因文库的实验基础。2. 应用纳米材料/技术进行白血病相关基因的功能鉴定及机制研究 2.1 进行白血病相关基因的功能鉴定及机制研究针对G蛋白耦联受体（GPCR）家族成员、Bcl11a、融合基因FUS-ERG和慢性粒细胞白血病与正常造血干/祖细胞间存在的表达差异基因（由转录组数据提示），选择适当的体外细胞模型使用已优化的基因递送方式转染细胞后，进行细胞增殖、细胞周期/凋亡和集落生成等多种检测以鉴定其功能。并选择其中的一些基因研究它们对某些白血病细胞在小鼠中致白血病或皮下成瘤能力的影响，必要时建立

6、适当的转基因动物模型进行研究。针对Bcl11a、FUS-ERG和本研究中新鉴定到的功能基因还将进行基因稳定表达、基因沉默和基因组学（microarray、array-CGH和ChIP-on-chip等）等多种机制学研究，以鉴定它们发挥作用的细胞内信号网络，并探讨它们作为新的治疗靶点的可行性。针对Bcl11a和本研究中新鉴定到的功能基因也将进行临床研究，以探讨它们作为人类白血病预后指标的临床价值。2.2 鉴定调控正常和白血病干细胞功能的基因：用流式细胞术分离表型为Lin-/Sca-1+/C-kit+的正常造血干细胞，或CD34+/CD38-或CD96+的急性髓系白血病干细胞，采用上述1中优化的纳

7、米材料搭载shRNA寡核苷酸文库递送入分离的干细胞，经体外培养或移植到受体鼠内，鉴定不依赖细胞因子且快速生长的干细胞克隆、或抗凋亡的干细胞克隆。对于这些克隆中受到表达抑制的基因，使用不同于文库中的shRNA进行验证（包括制备相应的转基因小鼠）。2.3 应用纳米材料鉴定白血病细胞中特异表达的E3泛素连接酶 利用已优化的纳米材料载体搭载泛素连接酶E3文库，并递送到可稳定表达转录因子c-maf和检测c-maf转录活性的荧光素酶报告基因的NIH3T3细胞，依据荧光素酶活性强弱，初步筛选出参与c-maf泛素化降解的特异性泛素连接酶E3，其后使用多种生物化学的实验方法加以确证。用RQ-RT-PCR方法分析

8、E3在血液病细胞中的表达水平，以探讨它的临床预后价值；在血液病细胞中过表达E3后观察细胞增殖的变化以评估它的临床治疗价值。同时利用点突变和定向突变的方法构建不同突变体深入分析其生物学功能。3. 探讨应用纳米技术标记细胞的新方法研究中枢神经系统白血病(CNSL)3.1 纳米颗粒体外标记白血病细胞及MRI成像用不同浓度的纳米颗粒标记SHI-1等白血病细胞，检测白血病细胞的生长增殖及凋亡、形态等情况的变化，应用MRI成像技术观察标记效率，掌握最佳标记浓度及效果。3.2 纳米示踪技术体内示踪白血病细胞的转移浸润用具有高侵袭力的SHI-1细胞系建立中枢神经系统白血病小鼠模型，将纳米示踪剂标记的SHI细胞

9、尾静脉接种于SCID小鼠，通过MRI等成像技术体内动态观察白血病细胞的浸润转移情况及转移方式，探讨其髓外转移浸润的相关机制，如对血脑屏障各层的破坏情况等。3.3 建立体外血脑屏障模型，观察白血病细胞对血脑屏障尤其是紧密连接蛋白等的破坏。利用人脑微血管内皮细胞及Matrigel胶及transwell系统模拟建立体外血脑屏障模型，观察纳米标记的白血病细胞对基底膜及紧密连接蛋白的破坏情况。二、在发展生物医用纳米探针与血细胞相互作用研究的原位、实时、动态新技术与新方法方面，学术思路是充分发挥学科集成与交叉优势，基于化学及分子生物学原理，从纳米探针设计、合成、组装和标记出发，构建具有特异性生物识别功能的

10、纳米探针，研究各类探针的生物效应，寻找生物医学探针设计的基本规律。利用所构建的生物医学探针，建立血液细胞实时动态监测的新技术和新方法，开展活体生命过程的实时、动态研究。具体路线如下：1. 生物纳米探针的构建和生物效应研究合成具有重要生物应用前景的纳米贵金属、磁性纳米材料、核壳结构纳米半导体材料（量子点）、树枝状大分子材料，通过自组装、层层组装、包埋、化学偶连等方法对这些纳米材料进行功能化修饰，使之具有良好的生物相容性和特异性识别血液细胞表面受体或细胞内特异性蛋白表达的功能。将生物纳米探针与血细胞共孵育，采用扫描探针显微（SPM）、激光扫描荧光共聚焦显微等方法，结合磁共振波谱及细胞生物学方法，研

11、究所构建的纳米探针对细胞膜作用、跨膜转运机制和动力学，跟踪并记录生物纳米探针所引起的血细胞的DNA损伤、线粒体膜电位变化、Caspase酶激活等生理变化，以获取血细胞内多种反应的动态化学信息、电化学信息及反映整体的功能状态。2 利用纳米探针特殊的光电化学性质，研究针对血液恶性肿瘤的特异基因及致病相关基因、蛋白质（如慢性髓系白血病(CML)的bcr/abl基因、融合蛋白P210等）的超微量、快速、高灵敏的检测新方法。3 设计特殊结构的通道，将各种微阀微泵微反应室等集成在芯片上，实现单细胞或群体细胞的操纵、分选、及实时监测，建立细胞与纳米粒子相互作用研究的功能化、集成化、自动化微流控芯片平台；基于

12、细胞图案化研究技术，利用细胞特异性识别的蛋白如抗体、适配体等，实现稀少细胞的筛选、富集，搭建集细胞捕获、培养、受激和响应为一体的在线原位细胞信号的检测平台。基于微流控芯片平台，利用纳米探针监控药物对血细胞的增殖、凋亡的影响，实现可寻址、实时、在线的高通量药物筛选研究。4 以HL-60细胞、K562细胞等白血病细胞为模型，采用电化学、电化学发光方法、荧光、生物质谱以及简单便捷的可视化检测模式，研究纳米探针的跨膜机制，与细胞表面及胞内组分作用的动态过程，并对细胞的凋亡进行原位诱导与检测，开展恶性血液病诊断和预后评估的基础性研究。三、在研究纳米材料对恶性淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞的作用和体内检测与诊断方

13、法方面，重点发展多模式、多靶点分子影像新理论和新方法。具体路线如下：1. 采用热分解法制备磁共振成像用高性能磁性纳米粒子，实现稳定的控制制备工艺，建立纳米氧化铁国家标准样品及MRI弛豫率标准定值方法。采用化学偶联技术将白血病、恶性淋巴瘤和骨髓瘤探针分子连接到磁性纳米粒子上，制备用于血液恶性肿瘤体内外检测的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针。利用冷冻干燥技术将磁性纳米探针制成冻干粉制剂，研究其稳定性、再分散性、生物相容性、MRI弛豫特性以及偶联方法对抗体活性的影响。2. 采用胶体化学方法研制新型金属纳米粒子CT造影剂或纳米探针，在进一步完善自主研制的Micro-CT的基础上，用于细胞/多细胞

14、成像的研究以及进行CT功能影像研究；采用纳米复合技术，研制结合磁性纳米颗粒的微气泡，用于磁共振-超声联合造影，研制磁性荧光双模探针用于磁共振光学联合影像研究，研制多模式联合成像及图像融合分析技术的研究。3. 建立淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤小鼠模型，结合Micro-MRI、Micro-CT和小动物光学或超声成像系统以及交流磁极化率测量系统，研究上述纳米探针特性及进入血液循环系统后的表面重构、自组装等对其生物分布和对靶器官（靶细胞）作用的影响；研究探针靶向性行为的尺寸、表面和聚集依赖性以及相关信号放大机制。4. 基于磁性纳米探针的的模拟酶特性，借助外加磁场及催化显色反应，实现对循环血管内皮细胞（

15、CEC）和循环肿瘤细胞（CTC）及相关标志物的捕获、磁分离和定量检测，进行特定肿瘤的临床诊断和预后。四、在研究纳米材料对血液免疫功能细胞的作用和白血病纳米免疫治疗方面，主要围绕纳米材料对树突细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的作用展开。通过深入探究纳米材料及其与白血病相关抗原的结合体对上述免疫细胞功能的作用，在考虑和评价纳米材料血液相容性的基础上，发展和建立白血病纳米免疫治疗技术和方法。具体路线如下：1. 纳米粒子表面功能化及免疫学效应研究采用化学修饰方法对纳米粒子表面分别做不同程度的氨基化、羧基化、PEG化修饰，调整和改变纳米粒子的物理化学性质。在细胞株模型上，分别采用细胞活性检测、流式细胞分析、激

16、光共聚焦、蛋白芯片、ELISA、western blot等方法和技术手段研究上述纳米粒子对淋巴细胞杀伤功能的影响，对巨噬细胞和树突细胞吞噬能力及产生细胞因子的组成和水平的影响。2纳米材料对巨噬细胞作用研究从白血病细胞系K562中提取白血病裂解抗原；从国外购入或获取白血病免疫治疗相关抗原，包括BCR-ABL, PML, PRTN3等。通过化学连接、物理吸附等方式将肿瘤抗原与纳米材料相结合，制备纳米材料与肿瘤抗原的复合物。分别选择巨噬细胞株、血液中巨噬细胞为模型，采用蛋白芯片、ELISA、western blot等方法和技术手段研究上述纳米粒子和肿瘤抗原复合物诱导巨噬细胞分泌细胞因子谱的变化；采用

17、细胞活性检测、流式细胞分析、激光共聚焦等方法研究巨噬细胞向不同功能的转化以及纳米材料对巨噬细胞亚型相互转化的阻遏作用。3. 纳米粒子对DC细胞的作用研究方案分离外周血单个核细胞，从中诱导培养出树突状细胞。采用化学诱导方法刺激原始树突细胞，与纳米材料或纳米材料与肿瘤抗原的复合物共孵育，将树突细胞和新鲜分离的外周血单个核细胞混合，利用细胞活性检测技术（MTS/ELISA）检测DC细胞诱导淋巴细胞抗肿瘤反应能力混合后的细胞对特定肿瘤靶细胞的杀伤作用；利用免疫磁珠技术分离技术、流式细胞分析技术研究载肿瘤抗原的纳米材料对DC细胞的成熟分化和肿瘤抗原递呈能力的影响。4对T淋巴细胞和T淋巴细胞性白血病细胞的

18、作用（1）T淋巴细胞和T淋巴细胞性白血病细胞膜的离子通道的功能活动特点及纳米材料的影响：利用膜片钳技术研究纳米材料、纳米材料与肿瘤抗原复合物对小鼠T淋巴细胞和人急性T淋巴细胞性白血病细胞的K+通道、Ca2+通道、Na+通道活动的作用。利用RT-PCR、Western blot技术和相应试剂盒检测纳米材料、纳米材料与肿瘤抗原复合物对离子通道蛋白表达及其它信号分子。利用共聚焦技术测定纳米材料、纳米材料与肿瘤抗原复合物引起细胞内钙信号的变化；利用光镜和电镜技术研究纳米材料的跨膜转运情况和细胞功能蛋白的表达动态变化。（2）纳米材料、纳米材料与肿瘤抗原复合物对免疫细胞和白血病细胞胆碱能信号系统的影响：利

19、用胆碱能受体亚型激动剂和阻断剂，配合功能研究技术，观察纳米材料和肿瘤抗原复合物对胆碱能受体亚型的作用；利用膜片钳技术测定纳米材料和肿瘤抗原复合物引起的N型乙酰胆碱受体激活后细胞膜的离子流变化情况；利用RT-PCR、免疫组化和Western blot技术鉴定各种受体亚型的表达情况。5纳米材料对外周血单个核细胞作用及信号通路的作用选取小鼠T淋巴细胞和人急性T淋巴细胞性白血病细胞为模型。利用免疫磁珠技术从外周血单个核细胞中分离不同的淋巴细胞亚群。采用细胞活性检测方法测定纳米材料和肿瘤抗原复合物对不同淋巴细胞亚群增殖、活化的影响。在细胞水平，检测纳米材料对外周血单个核细胞中ROS水平和TLR4的激活：

20、以2, 7-HDCF-DA作为探针，对细胞中表达CD14的单核细胞进行FACS检测ROS；应用FACS及荧光共聚焦显微镜，对人外周血单个核细胞进行TLR4标记，检测TLR4是否被激活；应用western blot方法检测人外周血单个核细胞TLR4-TRIF/MyD88-TRAF6-RIP/IRAK1-NF-kB信号通路的激活；应用NF-kB-Luc转基因小鼠的活体成像技术检测NF-kB的激活水平。6白血病纳米免疫治疗动物实验方案建立急性髓性白血病动物模型。通过上述细胞实验筛选出有效的纳米免疫治疗方案。以纳米材料和肿瘤抗原复合物免疫动物。采用动物生存曲线、流式细胞分析、各种相关ELISA试剂盒以

21、及RT-PCR和免疫组化等方法检测白血病纳米免疫治疗的效果、血液中淋巴细胞亚群变化、淋巴细胞对白血病细胞的特异性杀伤能力、细胞因子谱的组成和表达水平，评估不同实验组动物的抗肿瘤免疫效应。 7纳米材料在动物体内的分布以痕量放射性同位素或荧光分子标记抗原或纳米粒子，并将抗原与纳米粒子结合。通过测量同位素或荧光在不同组织和器官中的分布，观察其在体内的分布情况，特别注重其在淋巴结、脾脏等关键免疫器官中的分布。通过血液生化指标检测对接受纳米免疫治疗动物的肝肾功能进行评估；铜鼓组织病理分析对接受纳米免疫治疗动物的各个重要脏器分别进行组织学检查，评估其是否有明显的形态学变化。8纳米材料的血液相容性研究 将高

22、剂量和低剂量的磁纳米颗粒和碳纳米管通过尾静脉注入小鼠循环系。分别在4个月和12个月时，观察和测定受体鼠血液系统恶变相关的指标（如：白血病细胞鉴定和计数，小鼠生存期观察，流式细胞仪检测，组织病理学分析等）。四、年度计划研究内容预期目标第一年1构建针对多种白血病细胞模型的纳米载体，优化其基因递送条件。构建Gpr家族成员和Bcl11a等白血病相关基因的表达载体；收集、制备并测试shRNA文库；构建泛素连接酶E3的真核表达文库。进行t(16;21)(p11;q22) / FUS-ERG白血病临床入组病例筛选及临床研究；开展易位断裂点的精确定位和融合基因剪切型的定性及定量检测和多种基因组学分析。检测慢性

23、粒细胞白血病干/祖细胞相对于正常细胞差异表达的候选基因。建立纳米颗粒体外标记白血病细胞技术，观察纳米标记是否影响白血病的生物表型（如增殖，集落形成能力，凋亡，迁移和浸润能力等）；探讨以MRI为主的纳米示踪活体成像技术在动物体内示踪白血病细胞的转移浸润的可行性。2设计合成具有重要生物应用前景的纳米贵金属、磁性纳米材料、核壳结构纳米半导体材料（量子点）、树枝状大分子材料，采用表面分子设计和表面反应/组装方法对纳米材料进行功能化修饰；通过与特殊的血液恶性肿瘤标志物的偶联，制备特异性的纳米生物医学探针，并研究其血液相容性、稳定性及靶向性等生物效应。3制备高性能磁性纳米粒子，研究稳定的控制制备工艺，建立

24、纳米氧化铁国家标准样品及MRI弛豫率标准定值方法。利用抗体差异筛选肿瘤靶分子技术筛选白血病、恶性淋巴瘤和骨髓瘤等血液恶性肿瘤的靶点和相应抗体，制备用于血液恶性肿瘤体内外检测的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针，研究探针冻干粉制剂的制备工艺，研究其稳定性、再分散性、生物相容性、MRI弛豫特性以及偶联方法对抗体活性的影响。4在动物整体和细胞水平上研究纳米粒子表面的氨基化、羧基化、PEG化对对巨噬细胞的肿瘤细胞杀伤功能的调控规律；对血液中树突细胞成熟和分化的调控作用。研究不同纳米材料对T淋巴细胞及T淋巴细胞性白血病细胞K+通道、钙信号系统通道的影响；在动物整体和细胞水平上研究纳米材料对外周血淋巴

25、细胞ROS产生的影响规律。1建立高效基因纳米载体，并确定转染条件。构建成功各种表达载体、shRNA文库和E3表达文库。阐述伴t(16;21)(p11;q22)白血病的主要临床和实验室特征。确证慢性粒细胞白血病干/祖细胞相对于正常细胞差异表达的候选基因。建立中枢神经系统白血病小鼠模型，初步建立纳米示踪动态观察白血病的髓外浸润途径及时间的方法。2研制出几类具有特异性生物识别和示踪功能的光学、磁学及电化学生物纳米探针；阐明纳米探针结构与功能的关系。3制备出纳米氧化铁标准样品，找到血液恶性肿瘤的靶点和对应的抗体，制备磁性纳米探针冻干粉制剂，建立检测循环血管内皮细胞（CEC）和循环肿瘤细胞（CTC）的方

26、法，构建用于血液恶性肿瘤体内外检测的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针。4建立比较完善的纳米粒子的表面修饰技术平台；初步阐明不同表面构成的纳米材料对巨噬细胞肿瘤杀伤功能的作用规律；初步阐明不同纳米材料对血液中树突细胞成熟和分化的调控作用；初步揭示不同构成的纳米材料对T淋巴细胞及T淋巴细胞性白血病细胞K+通道、钙信号系统通道的影响；初步阐明不同构成的纳米材料诱导ROS产生的规律。发表22篇左右SCI研究论文。第二年1基于纳米基因递送系统，在小鼠模型上探讨Gpr家族成员的功能；用ChIP-on-Chip法研究Bcl11a基因的转录调节网络中的下游调控基因。继续开展伴t(16;21)(p11;q

27、22)白血病的临床研究；常见急性髓系白血病异常表达基因的定量检测和基因组学分析；克隆FUS-ERG融合基因，构建载体。构建慢性粒细胞白血病相关基因的cDNA表达载体或shRNA载体。进行正常或白血病干/祖细胞的shRNA筛选实验。基于纳米氧化铁的血细胞E3基因递送体系，开展对E3文库的筛选。完善和优化白血病细胞体内浸润检测的技术和方法，基于纳米标记，研究白血病细胞对血脑屏障尤其是紧密连接蛋白等的破坏。2将生物纳米探针与血细胞共孵育，采用扫描探针显微（SPM）、激光扫描荧光共聚焦显微等方法，结合磁共振波谱及细胞生物学方法，研究所构建的纳米探针对细胞膜作用、跨膜转运机制和动力学，跟踪并记录生物纳米

28、探针所引起的血细胞的DNA损伤、线粒体膜电位变化、Caspase酶激活等生理变化，以获取血细胞内多种反应的动态化学信息、电化学信息及反映整体的功能状态。3对所构建的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针检测循环内皮细胞和循环肿瘤细胞的特异性、抗干扰性及稳定性进行评价和优化研究。采用胶体化学方法研制新型金属纳米粒子CT造影剂，以及构建含发光量子点的碘油纳米乳造影剂，构建特异性纳米探针，在进一步完善自主研制的Micro-CT的基础上，结合光学影像技术，开展细胞/多细胞成像的研究以及进行CT功能影像研究。设计和研究多模式、多靶点医学影像纳米探针，研制用于磁共振-超声联合造影的磁性纳米颗粒微气泡，研制

29、磁性荧光双模探针用于磁共振光学联合影像研究，以及后续多模式联合成像及图像融合分析技术的研究。建立恶性淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤小鼠模型。4在动物整体和细胞水平上研究纳米材料对巨噬细胞不同亚型转换的调控作用；继续在在动物整体和细胞水平上深入研究纳米粒子对树突细胞的修饰和免疫功能的调控作用；在动物整体和细胞水平上初步研究纳米材料对外周血淋巴细胞产生细胞因子风暴信号通路相关的炎性反应上游激活机制；初步开展纳米材料对白血病细胞胆碱能信号系统的作用，及其表达和功能的改变在免疫细胞功能活动中的意义。1初步鉴定Gpr家族在白血病中的功能；初步理解一部分Bcl11a基因的转录调节网络中的下游调控基因。阐述伴

30、t(16;21)(p11;q22)白血病的主要遗传学特征，克隆FUS-ERG融合基因。成功构建慢性粒细胞白血病相关基因的cDNA表达载体或shRNA载体。获得shRNA初步筛选结果。构建出纳米Fe3O4-E3 DNA 血细胞基因递送体系并筛选出特异性的E3连接酶，初步完成其功能研究。成功建立体外血脑屏障模型，初步获得某些基因或信号通路对白血病体内外浸润，迁移，穿透等能力的影响的实验数据和实验依据。2阐明几类重要的生物纳米探针对血液恶性肿瘤细胞的体外作用机制，示踪并检测生物纳米探针所引起的血细胞的体外凋亡等。3评价并优化检测循环内皮细胞和循环肿瘤细胞的方法。研制出Micro-CT、用于磁共振-超

31、声联合造影的结合磁性纳米颗粒的微气泡，以及磁性荧光双模探针，建立多模式联合成像及图像融合分析技术。得到恶性淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤小鼠模型，用于后续研究。4进一步阐明纳米粒子对巨噬细胞功能转换的作用规律及与白血病治疗之间关系；进一步阐明纳米粒子对树突细胞成熟与分化的作用规律；初步阐明纳米材料对外周血淋巴细胞产生细胞因子风暴信号通路相关的炎性反应上游激活机制；初步阐明纳米材料对白血病细胞胆碱能信号系统的作用。发表24篇左右SCI研究论文。第三年1基于纳米基因递送系统，在细胞培养实验体系中探讨Gpr家族成员的生物学功能及机制；定量分析Bcl11a在各种中国白血病人中的表达水平。完成干/祖细胞中

32、shRNA文库的筛选工作。对伴有 t(16;21)(p11;q22)白血病进行基因组学分析和RQ-RT-PCR验证。使用纳米材料进行多个慢性粒细胞白血病相关基因的基因递送，进一步研究E3在恶性血液病（白血病和多发性骨髓瘤）中的发生、治疗和诊断中的意义，并完成E3的结构突变体的分析。在成功建立白血病细胞浸润和穿透血脑屏障的体内外模型和优化基于纳米材料的监测方法的基础上，针对某2-3种相关基因和作用通路，应用转基因，基因敲除或信号通路抑制剂的干预，深入研究这些基因或信号分子在白血病细胞浸润分子机理中所起的作用。2基于纳米探针特殊的光电化学性质，研究针对血液恶性肿瘤的特异基因及致病相关基因、蛋白质（

33、如慢性髓系白血病(CML)的bcr/abl基因、融合蛋白P210等）的超微量、快速、高灵敏的检测新方法。制备出新型超微量、快速、高灵敏检测血液恶性肿瘤标志物的光电化学医用传感器。3基于磁性纳米粒子的模拟酶特性，借助外加磁场及催化显色反应，研究针对循环恶性淋巴瘤细胞、骨髓瘤和循环血管内皮细胞（CEC）的磁分离富集与检测相结合的新型免疫测定方法。与临床医院合作，选取血液系统恶性肿瘤的病人50例，跟踪采取血样，研究循环内皮细胞与循环肿瘤细胞在血液中的数量，与其疾病发展的关系。4探索和优化纳米材料与肿瘤相关抗原的结合方法，初步研究结合物是否能够促进肿瘤抗原的递呈并调控相关的抗肿瘤（抗白血病）的免疫效应

34、。在动物整体和细胞水平上继续研究纳米材料对外周血淋巴细胞产生细胞因子风暴信号通路相关的炎性反应上游激活机制。深入研究纳米材料对白血病细胞胆碱能信号系统的作用，及其表达和功能的改变在免疫细胞功能活动中的意义。1阐述Gpr家族成员在小鼠模型中的过表达是否参与诱发白血病；阐明 Bcl11a的表达水平和各种中国人白血病的关系。筛选到若干可能影响干细胞生长、凋亡的shRNA。鉴定参与FUS-ERG融合基因致白血病机制的基因。在慢性粒细胞白血病细胞模型中，初步确定若干可影响细胞增殖、凋亡的候选基因。完成E3在恶性血液病细胞中的表达谱，预测其功能。并发现E3特异性功能域。获得2-3种基因或信号分子在白血病细

35、胞浸润和穿透血脑屏障形成中枢神经系统白血病过程中的确切作用和机理。2研制出几种高灵敏的检测血液恶性肿瘤细胞及其标志物的光电化学医用传感器；3实现对循环血管内皮细胞（CEC）和循环肿瘤细胞（CTC）及相关标志物的捕获、磁分离和定量检测，进行特定肿瘤的临床诊断和预后。获得循环内皮细胞与循环肿瘤细胞的数量与血液系统恶性肿瘤发展过程的直接证据。以此判断该检测方法在临床诊断和预后评价中的意义。4建立肿瘤抗原与纳米材料的有效连接技术；初步阐明不同连接方法对促进肿瘤抗原递呈以及对白血病治疗的作用规律；阐明纳米材料对外周血淋巴细胞产生细胞因子风暴信号通路相关的炎性反应上游激活机制；进一步明确纳米材料对白血病细

36、胞胆碱能信号系统的作用规律。发表27篇左右SCI研究论文，申请发明专利5-6项。 第四年1研究Gpr家族成员过表达对体外培养细胞的影响和可能的致病机制。研究Bcl11a对某些下游基因表达的调控机理；研究Bcl11a异常在白血病治疗应答中的作用。完成基因组学分析以及RQ-PCR验证；开展RNA干扰实验，对筛选出的差异表达候选基因采用RQ-RT-PCR或RQ -PCR检测其表达情况；开展FUS-ERG基因的体外转染实验及后续的芯片、定量PCR、软琼脂实验和裸小鼠皮下成瘤实验等工作。对12个影响慢性粒细胞白血病细胞功能的候选基因进行深入的基因表达和基因沉默实验，并使用动物模型研究其功能。验证筛选到的

37、可能影响干细胞生长、凋亡的shRNA。对E3蛋白质晶体结构进行分析，并研究E3与靶标蛋白c-maf的分子对接和相互作用。通过较多临床病例的检测和临床资料的相关分析，探讨应用这些基因或信号分子作为中枢神经系统白血病的高危预警和诊断的生物标记的可行性和有效性。同时在动物模型或体外血脑屏障模型上尝试针对某一分子进行靶向干预来防止中枢神经系统白血病发生的可能性。2设计特殊结构的通道，将各种微阀微泵微反应室等集成在芯片上，实现单细胞或群体细胞的操纵、分选、及实时监测，建立细胞与纳米粒子相互作用研究的功能化、集成化、自动化微流控芯片平台；基于细胞图案化研究技术，利用细胞特异性识别的蛋白如抗体、适配体等，实

38、现稀少细胞的筛选、富集，搭建集细胞捕获、培养、受激和响应为一体的在线原位细胞信号的检测平台。基于微流控芯片平台，利用纳米探针监控药物对血细胞的增殖、凋亡的影响，实现可寻址、实时、在线的高通量药物筛选研究。3根据前期建立的恶性淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤小鼠模型，结合Micro-MRI、Micro-CT和小动物光学或超声成像系统，研究纳米探针特性及进入血液循环系统后的表面重构、自组装等对其生物分布和对靶器官（靶细胞）作用的影响；研究探针靶向性行为的尺寸、表面和聚集依赖性以及相关信号放大机制。4深入研究纳米粒子与肿瘤抗原结合物是否能够促进肿瘤抗原的递呈并调控相关的抗肿瘤（抗白血病）的免疫效应。研究

39、纳米粒子从血液循环进入体内后的分布，特别是在肺、脾脏和淋巴结等循环器官和关键免疫器官中的分布状况。1阐明Gpr家族成员等白血病相关基因在白血病发生中的作用机制。明确Bcl11a信号网络的调控机理；阐明Bcl11a异常在白血病治疗应答中的作用。使用伴有t(16;21)(p11;q22)的白血病样本对所筛选到的差异表达基因完成定量验证。确定候选基因在CML中的功能，并探讨该基因产物成为预后指标及治疗靶点的可行性。确证筛选到的shRNA，明确对应基因在干/祖细胞中的重要功能。初步阐明E3-c-maf间的相互作用。初步提出可用于中枢神经系统白血病的高危预警和诊断的某些分子标记，并提出预防其发生的可行策

40、略。2建立和完善利用生物纳米探针来动态监测血液恶性肿瘤细胞增殖、凋亡等生理变化的技术平台；发展高通量的筛选血液恶性肿瘤治疗药物的微芯片平台。3阐明纳米探针进入血液循环系统后的变化及对机体影响，阐明纳米探针特性的作用机制。4进一步明确纳米粒子与肿瘤抗原复合物促进肿瘤抗原递呈并调控相关抗肿瘤免疫效应的条件和作用机制；初步探明纳米粒子从血液循环进入体内后在关键免疫器官中的分布。发表27篇左右SCI研究论文，申请发明专利68项。第五年1深入研究Gpr家族成员或其它白血病相关基因可能导致白血病的分子机制；研究Bcl11a及其下游调控靶基因的表达对白血病细胞的作用；进一步探索筛选到的新的白血病相关基因的作

41、用。完成差异表达候选基因的筛选和RQ-PCR验证；完成FUS-ERG基因的体外基于纳米材料的转染和裸鼠成瘤实验等工作。在适合的细胞模型进行慢性粒细胞白血病致病相关基因的分子机制研究。完成E3在白血病或其他恶性血液病中的临床研究。继续在临床上更多的各亚型白血病患者中验证和完善中枢神经系统白血病预警和诊断的分子标记。继续体外和动物体内的靶向干预研究，在适当的时候，在部分患者中实施干预策略。2以HL-60细胞、K562细胞等白血病细胞为模型，采用电化学、电化学发光方法、荧光、生物质谱以及简单便捷的可视化检测模式，研究纳米探针的跨膜机制，与细胞表面及胞内组分作用的动态过程，并对细胞的凋亡进行原位诱导与

42、检测，开展恶性血液病诊断和预后评估的基础性研究。3采用优化的纳米探针对小鼠模型中肿瘤的发生、发展以及化疗药物干预进行分子影像学示踪和监测，实现对肿瘤的靶向及对肿瘤新生血管的分子成像，对肿瘤发生、发展、转移（浸润）的过程进行影像学研究，结合化疗药物（或抗体药物）的干预，研究对治疗效果的分子影像学评价方法，为淋巴瘤、骨髓瘤等血液恶性肿瘤的早期检测和疗效评价提供依据和方法。4研究纳米粒子从血液循环进入体内后对肝、肾、脾功能，特别是造血功能的影响，确定纳米材料在血液循环系统安全应用的水平。全面总结纳米粒子对血液免疫细胞的作用，研究安全的白血病纳米免疫治疗方法。1阐述Gpr家族成员或其它白血病相关基因可

43、能导致白血病的分子机制；进一步理解Bcl11a基因的导致白血病的作用机制；确证上述工作中可能寻找到的新的白血病相关基因。完成FUS-ERG融合基因致白血病机制的细胞和动物实验。阐明致病相关基因在慢性粒细胞白血病中的分子机制，提供该基因蛋白产物可能成为预后指标或治疗靶点的理论和实验基础。阐明E3在白血病中的生物学功能和临床诊治意义。进一步确定这些分子标记在对中枢神经系统白血病高危预警和诊断中的临床价值，在恰当的范围内推广。2发展1-2种有临床应用前景的、可以为血液恶性肿瘤的诊断和预后评估提供帮助的新技术和新方法。3实现对肿瘤的靶向及对肿瘤新生血管的分子成像，对肿瘤发生、发展、转移（浸润）的过程进

44、行影像学追踪，建立对治疗效果的分子影像学评价方法。4明确纳米粒子从血液循环进入体内后对肝、肾、脾功能，特别是造血功能的影响，确定纳米材料在血液循环系统安全应用的水平。对课题进行全面总结，确立13种提升抗白血病免疫反应的纳米材料，建立相关应用技术流程和方法，建立针对T淋巴细胞性白血病的纳米免疫治疗新方法。发表35篇左右研究论文，申请发明专利68项。一、研究内容血液是维持机体正常运转、保证机体处于健康状态的核心要素。血细胞在造血器官或组织中产生，发育成熟或接近成熟时才释放到血液中。当发生先天性造血功能缺陷或骨髓成分的恶性转变，会导致血液恶性肿瘤的发生。本项目的核心科学问题是具有生物医学应用前景的纳

45、米材料对血细胞的作用过程及其机理，探索相关纳米材料与器件在血液恶性肿瘤的发病机制、早期检测与诊断、临床干预和治疗中的新理论和新方法。主要研究内容如下：1纳米探针的设计、合成、构建及生物效应研究利用单克隆抗体技术、指数富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选针对不同血液恶性肿瘤的标志物；基于纳米技术和分子生物学技术，构建具有特异性生物识别和示踪功能的纳米探针；研究用于血液恶性肿瘤体内检测的磁性纳米粒子诊断制剂和医学影像纳米探针的构建方法。通过对纳米粒子的表征、疾病标志物在粒子表面的活性研究，探索纳米探针的结构与功能关系。2纳米探针与靶细胞的体外作用过程及检测研究构建血细胞动态生理过程研究的微流控芯片平台；研究纳米探针与正常血细胞的相互作用，研究纳米探针的血液相容性、靶向性；研究纳米探针与血液恶性肿瘤细胞的作用，发展血液恶性肿瘤细胞的原位、实时、动态信息的采集和分析新方法。3以纳米材料为基因载体筛选白血病相关基因的研究建立适合恶性血液病研究中常用的细胞模型的纳米载体基因递送系统；基于纳米载体对基因的高效递送，结合遗传筛选策略和基因分子成像技术，利用小鼠模型和骨髓细胞体外培养实验体系，寻找与干细胞生长、凋亡相关的基因。明确Gpr家族成员、Bcl11a和FUS-ERG等白血病相关基因