生化实验设计

1、成都医学院大学生实验设计项目立题报告书课 题名称：测定不同时间泡菜中亚硝酸盐含量的变化研 究方向：物质含量检测专业、班级 ：2013级临床本科八班学生姓名：徐良震1325100408陈 强1325100409王镜洁1325100410带教教师：王丹实验室名称        生物技术实验教学中心2014年12 月21日实验名称：测定不同时间泡菜中亚硝酸盐含量的变化一 实验设计的目的及意义1、目的与意义:  人们自制腌制泡菜腊肉时，由于部分有害微生物和硝酸还原

2、酶的作用，会将硝酸盐转化为亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种致癌物，摄入过量将会对人体造成危害，本实验探究制作泡菜时亚硝酸盐含量的变化趋势和最高的时期，从而有效避免亚硝酸盐中毒。这是本实验的意义所在。2、国内外研究现状：（1）100年来，科学家认为亚硝酸盐没有任何益处，但是今天，科学家却发现了它的价值所在。据美国全波广播公司报道，在研究一种与亚硝酸盐相关的化合物氧化一氮时，马克 T格拉德温博士和心脏病专家理查德-坎农博士意外发现了亚硝酸盐的药用价值。氧化一氮可以扩张血管，进而增加血液流量，但无法用作药物。不过，经常被用作食品防腐剂的亚硝酸盐却有着和氧化一氮相似的功效，而且可以入药，所以两位科学家想到了亚

3、硝酸盐。随后，科学家进行了临床试验。他们给健康的志愿者注入微量亚硝酸盐，结果志愿者体内血液流量增加了两倍，而当志愿者运动时，体内的亚硝酸盐含量马上直线下降，说明身体正在积极使用亚硝酸盐。所以，科学家认为，亚硝酸盐可以用作药物，用来治疗镰状细胞血症、心脏病、脑动脉瘤等和血液流量有关的疾病。（2）一项最新研究发现，涂抹在热狗上，使它呈现好看的粉色和防止大红肠腐肉中毒的化学物质，可能会增加患膀胱癌的风险。     研究人员通过对30万人进行分析，得出了这一结论，他们将矛头指向亚硝酸盐和硝酸盐，这些化合物添加到肉食里是为了防止肉类变质，让它们的颜色更好看，味道更

4、美。     每年大约有7万名美国人被确诊为膀胱癌，美国总人口中有超过2%的人最终会患上这种病。她说：“然而接触其他化合物也可能引发膀胱癌。我们开始研究在肉食里(在煮肉过程形成的杂环胺和稠环芳烃，或者在保存过程产生的硝酸盐和亚硝酸盐)发现的化合物是否会引发膀胱癌。”    为了进行这项研究，克洛斯和她的同事们采用了从1995年开始的一项美国国立卫生研究院-美国退休人员协会研究收集的资料，该协会进行的这项研究对美国全国的300933名老年男性和女性进行了追踪调查。    试验参与者填写了

5、一份调查问卷，回答一些有关他们吃什么肉、如何处理和烹制肉食的问题。然后研究人员把这份数据与实验室检测的肉类成分进行比对。在这项为期7年的研究期间，总共有854名参与者(不超过0.3%)被确诊患上了膀胱癌。（3）亚硝酸盐是肉制品加工过程中常用的添加剂，其有发色剂及防腐剂的性能，有利于肉类制品长期储存，如果肉制品中亚硝酸盐或硝酸盐使用量超过一定标准时，就会产生有毒有害物质，所以国家对食品中亚硝酸盐含量有严格的规定。3、解决问题的思路：  问题：样品采集时，同一组的不同区域的亚硝酸盐含量可能差别较大。影响实验结果。 办法：均匀取样，取平均值。二 .实验研究方案（一）研究内容1制备

6、泡菜（以红萝卜作原料）；2取不同天数（从第六天起）泡菜等量检测亚硝酸盐的含量；3分析数据得出亚硝酸盐含量的最高时期和变化趋势。（二）研究方法 亚硝酸盐含量测定的方法在弱酸性介质中，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮反应，生成的重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶联成紫红色的偶氮染料，在540nm处测定其吸光度，与标准比较定量，根据标准曲线计算亚硝酸盐含量。W(NaNO2) =式中:W(NaNO2 ) 泡菜中亚硝酸盐的含量(mg/ kg) ；M 样品的质量(g)m 标准曲线计算样品中亚硝酸盐的质量(g)；V 处理样品定容的总体积（mL）；V1 测样体积（mL）(三)技术路线及实验方案1技术路线

7、2 实验步骤：（1）泡菜的腌制购买一定数量的红萝卜，将其洗净、去皮，晾晒后，切成条状,放于泡菜坛中，加入一定调料；以清水和盐4:1的比例配制盐水，煮沸，冷却，然后倒入坛中，盐水须没过蔬菜；密封泡菜坛，置于阴凉处，温度控制在2830，等待发酵。（2）溶液的配制a） 配制4mg/ml对氨基苯磺酸溶液，配制2mg/mlN-1萘基乙二胺盐酸盐溶液，配制5ug/ml亚硝酸钠溶液，配制提取剂。 b)亚硝酸盐标准液的配制：用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亚硝酸钠溶液，分别置于50ml比色管中，并分别加入2.0ml对氨基苯磺酸溶液，混匀，

8、静置35分钟后，再分别加入1.0ml N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml，混匀。（3）样品的制备 从第五天开始至第十三天结束，每隔一天分别称取0.4千克泡菜，榨汁过滤得200ml汁液。取其中100 ml至500ml容量瓶中，加200ml蒸馏水、 100ml提取剂，混匀，再加入40ml氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至500ml后，立即过滤。将60ml滤液转移至100ml容量瓶中，加入氢氧化铝（吸附脱色）乳液，定容至100ml，过滤，得到所需溶液。（4）亚硝酸盐标准曲线的绘制准确移取NaNO2标准使用液（5ug/mL）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0于25mL的

9、比色管中。依次加入4.5mL NH4Cl缓冲溶液、2.50mL 60%的乙酸溶液后，立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度线，混匀，暗处静止25min，用1cm比色皿，以水做参比，于波长550nm处，测定其吸光度。以NaNO2质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。亚硝酸盐标准曲线NaNO2/mL00.51.01.52.02.53.0A540根据数据绘制图表（5）泡菜样品中NaNO2含量测定移取25.00mL3.3.1步骤中制的的滤液样品于25mL比色管中，依次加入4.5mL NH4Cl缓冲溶液、2.50mL 60%的乙酸溶液后，立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度线，混匀，暗处静止25mi

10、n，用1cm比色皿，以水做参比，于波长550nm处，测定其吸光度。W(NaNO2) =最后根据此式计算出泡菜最后根据此式计算出，泡菜中亚硝酸盐含量并根据绘制图表。3 实验结果分析   在腌制泡菜样品的前段时间亚硝酸盐含量在增加，第七天左右亚硝酸盐含量达到峰值，往后亚硝酸盐含量逐渐减少，所以腌制泡菜的时间不得少于一周，否则泡菜中含有较多量亚硝酸盐，长期食用此种泡菜会对身体造成伤害。（四）预期效果泡菜中亚硝酸盐含量天数/天5791113NaNO2/mL根据图表数据可得一张亚硝酸盐含量变化趋势图三 .所需实验材料与仪器1.仪器设备情况：721型分光光度计(上海

11、精密科学仪器有限公司)、250ml容量瓶、100ml容量瓶、比色管、比色皿、烧杯、玻璃棒、滤纸、胶头滴管。 2.实验待测品来源：  样品来源于自己腌制的泡菜(原料：市售红萝卜，1.2元/公斤) 3.药品试剂来源：  氨基苯磺酸， N-1萘基乙二胺盐酸盐，亚硝酸钠，氯化镉，氯化钡，氢氧化铝，盐酸，氢氧化钠（购自四川航嘉生物医药科技有限责任公司）。 四.参考文献：1 饶青等.四川泡菜产品特点及产业技术发展浅析J.食品与发酵科技,2011,(47),3-4.2 王艳鸽等.食品工业有害菌技术检测研究J.山西食品工业,2005，(02)，5-7.3 柏林

12、洋,宋金海,冯刚.亚硝酸盐检测方法的研究进展J.广州化工,2011,(13),31-334 范亚娜, 盖轲.几种腌制蔬菜中亚硝酸盐含量的测定J. 宝鸡文理学院学报(自然科学版), 2008,(01),5-6.5李富兰,颜杰,郭金全,等.水质中微量亚硝酸盐的测定.J.中国酿造,2010,219(6),160-1626 吴卿.影响生活饮用水中细菌总数指标与评论J.卫生研究.2007,(03),4-7.7 李建,黎晨晨,刘宁,等.化学发光法测定干肠中的亚硝酸盐.J.食品科学,2009,30(20),383-386.8 于保霞. 食品中亚硝酸盐含量的测定J. 河北化工, 2010,(03),5-7.9 Eklund M.W.Wieler D.I.,Poysky F .T.Outgrowth and toxin production of nonproteolytic type B Clostridium botulinu