质粒DA分离纯化

1、n质粒是染色体外的质粒是染色体外的dnadna分子分子, ,大小可为大小可为1kb1kb到到200kb200kb。n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子状的分子, ,以超螺旋形式存在。它是细菌内以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。的共生型遗传因子。n其复制和遗传独立于细菌染色体其复制和遗传独立于细菌染色体, ,但复制和但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。一、实验原理一、实验原理q煮沸法原理煮沸法原理 染色体染色体dnadna比质粒比质粒dnadna分子大得多分子大得多, ,且染色体且染色体dnadna为为

2、线状线状分子分子, ,而质粒而质粒dnadna为共价闭合环状分子为共价闭合环状分子; ; 当加热处理当加热处理dnadna溶液时溶液时, ,线状染色体线状染色体dnadna容易发生变性容易发生变性, ,共共价闭环的质粒价闭环的质粒dnadna在冷却时即恢复其天然构象在冷却时即恢复其天然构象; ; 变性染色体变性染色体dnadna片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀沉淀, ,而复性的超螺旋质粒而复性的超螺旋质粒dnadna分子则以溶解状态存在液分子则以溶解状态存在液相中相中, ,从而可通过离心将两者分开。从而可通过离心将两者分开。q碱裂解法原理碱裂解法原理 当

3、用碱处理当用碱处理dnadna溶液时溶液时, ,线状染色体线状染色体dnadna容易发生变性容易发生变性, ,共价共价闭环的质粒闭环的质粒dnadna在回到中性在回到中性phph时即恢复其天然构象时即恢复其天然构象; ; sdssds是一种阴离子表面活性剂是一种阴离子表面活性剂, ,它既能使细菌细胞裂解它既能使细菌细胞裂解, ,又能使又能使一些蛋白质变性一些蛋白质变性, ,所以所以sdssds处理细菌细胞后处理细菌细胞后, ,会导致细菌细胞壁会导致细菌细胞壁的破裂的破裂, ,从而使质粒从而使质粒dnadna以及基因组以及基因组dnadna从细胞中同时释放从细胞中同时释放出来。释放出来的出来。释

4、放出来的dnadna遇到强碱性遇到强碱性(naoh)(naoh)环境环境, ,就会变性。就会变性。然后然后, ,用酸性乙酸钾来中和溶液用酸性乙酸钾来中和溶液, ,使溶液处于中性使溶液处于中性, ,质粒质粒dnadna将将迅速复性迅速复性, ,而基因组而基因组dna,dna,由于分子巨大由于分子巨大, ,难以复性。离心后难以复性。离心后, ,质质粒粒dnadna将在上清中将在上清中, ,而基因组而基因组dnadna则与细胞碎片一起沉淀到则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒离心管的底部。通过这种方法即可将质粒dnadna从细菌中提取从细菌中提取出来。出来。q碱裂解法流程图碱裂

5、解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液iii中和中和溶液溶液i充分重悬充分重悬溶液溶液ii裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒dna溶液溶液菌种菌种 :e. coli mv1184(含puc118)、 e. coli k12(含pegfp)设备设备 :eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l), 台式高速离心机, 涡旋振荡器试剂试剂: :lb液体培养基 、溶液、溶液、溶液 、rna酶a 、饱和酚:氯仿 1:1 二、材料、设备及试剂二、材料、设备及试剂 溶液溶液:50mm 葡萄糖;25mm trishcl(ph8.0)

6、;10mm edta溶液溶液:(新鲜配制)0.2n naoh;1 sds溶液溶液:5m kac 10ml;冰醋酸 11.5ml;水 28.5ml1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 4、加入新配制的溶液200l, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 5、加入150l预冷的溶液,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下1200

7、0g离心5-10分钟。 6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4下12000g离心5分钟。 7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟,然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70乙醇洗沉淀一次,4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20l te缓冲液(ph8.0,含20g /ml rnasea)中,储于-20冰箱中。 三、操作步骤三、操作步骤

8、 实验结果实验结果:获得质粒获得质粒dna(puc118及及pegfp) 使用处于对数期的新鲜菌体使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌老化菌体导致开环质粒增加体导致开环质粒增加) 培养时应加入筛选压力培养时应加入筛选压力,否则菌体易否则菌体易污染污染,质粒易丢失质粒易丢失 尽量选择高拷贝的质粒尽量选择高拷贝的质粒,如为低拷贝如为低拷贝或大质粒或大质粒,则应加大菌体用量则应加大菌体用量 菌株不要频繁转接菌株不要频繁转接(质粒丢失质粒丢失) 菌体量适当。菌体量适当。 培养基去除干净培养基去除干净, ,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长变性的时间不要过长

9、(5(5分钟分钟), ),否则质粒易被打断。否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长复性时间也不宜过长, ,否则会有基因组否则会有基因组dnadna的污染。的污染。 g g菌、酵母质粒的提取菌、酵母质粒的提取, ,应先用酶法或机械法处理应先用酶法或机械法处理, ,以以破壁。破壁。 采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离dnadna时时, ,应应提供相应的缓冲体系提供相应的缓冲体系 采用有机采用有机( (酚酚/ /氯仿氯仿) )抽提时应充分混匀抽提时应充分混匀, ,但但动作要轻柔动作要轻柔 离心分离两相时离心分离两相时, ,应保证一定的转速和时应保证一定的转速和时间间 针对不同材料的

10、特点针对不同材料的特点, ,在提取过程中辅以在提取过程中辅以相应的去杂质的方法相应的去杂质的方法 当沉淀时间有限时当沉淀时间有限时, ,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀用预冷的乙醇或异丙醇沉淀, ,沉淀沉淀会更充分会更充分 沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的naac(ph5.2,3m),naac(ph5.2,3m),有利于充有利于充分沉淀分沉淀 沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤, ,以除去盐离子等以除去盐离子等 晾干晾干dna,dna,让乙醇充分挥发让乙醇充分挥发( (不要过分干燥不要过分干燥) ) 若长期储存建议使用若长期储存建议使用tete缓冲液溶解缓冲液溶解tete

11、中的中的edtaedta能螯和能螯和mgmg2+2+或或mnmn2+2+离子离子, ,抑制抑制dnasednasephph值为值为8.0,8.0,可防止可防止dnadna发生酸解发生酸解 1. 1.菌体老化菌体老化2.2.碱裂解不充分碱裂解不充分3.3.菌体中无质粒菌体中无质粒4.4.溶液使用不当溶液使用不当1. 1.请涂布平板培养后请涂布平板培养后, ,重新挑选重新挑选新菌落进行液体培养新菌落进行液体培养2.2.可减少菌体用量或增加溶液可减少菌体用量或增加溶液的用量的用量3.3.不要频繁转接不要频繁转接, ,每次接种时应每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正

12、确。用浓度是否正确。4.4.溶液溶液在温度较低时可能出在温度较低时可能出现浑浊现浑浊, ,置于置于3737保温片刻直保温片刻直至溶解为清亮的溶液至溶解为清亮的溶液。q问题一问题一: :未提出质粒或质粒得率较低未提出质粒或质粒得率较低, ,如何解决如何解决? ? 原原因因对对策策1. 1.混有蛋白混有蛋白2.2.混有混有rnarna3.3.混有基因组混有基因组dnadna1. 1.不要使用过多菌体。重新纯化不要使用过多菌体。重新纯化dna,dna,去除蛋白、多糖、多酚等去除蛋白、多糖、多酚等杂质杂质2.2.加入加入rnasearnasea室温放置一段时间室温放置一段时间3.3.加入溶液加入溶液i

13、i ii 和和iiiiii后后防止剧烈振荡防止剧烈振荡, ,可能把基因组可能把基因组dnadna剪切成碎片剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和时间过长会导致细胞和dnadna的的降解降解, ,培养时间不要超过培养时间不要超过1616小时小时。q问题二问题二: :质粒纯度不高质粒纯度不高, ,如何解决如何解决? ? 原原因因对对策策1. 1. 简要叙述溶液简要叙述溶液、溶液、溶液和溶液和溶液的作用的作用, ,以及实验中以及实验中 分分别加入上述溶液后别加入上述溶液后, ,反应体系出现的现象及其成因。反应体系出现的现象及其成因。2. 2. 染色体染色体

14、dnadna与质粒与质粒dnadna分离的主要依据是什么分离的主要依据是什么? ?西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，中医长期停滞不前、疗效也不确

15、实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小sars、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车，风马牛不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 至于循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上

16、一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学” （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff）华中科技大学、郑州大学等学校。 （df肺25s血液f369血小板t51

17、72红血球gdf55m白血球fd2）中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人们与疾病长期斗争的经验总结及阴阳五行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论体系。它为人类尤其为中国人民（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65

18、io肠癌.f2tr肺癌65ff）健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响

19、各自发展。事实也证明这一切，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）中医长期停滞不前、（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小sars、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2），风马牛

20、不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）至于（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完整性的瑕疵，即都是以不完整的人为研究对象的医学科学，故不能解决目前存在于中西医学甚至人文社会科

21、学史上一切疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切疑难模糊问题，显然已完全超出了中（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）西医学所涉及的范畴，我们必须跳出中西医学的理论框架，建立起一个新的医学理论体系 - 东方医学和西方医学（即西医）的融合形成现代系统医学。该体系所涉及的一切问题不管从广度上，还是从深度上，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）都应该远远超过现有的中西医学理论，并将现有中西医学理论纳入自己的理论框架范围之内。为了肩负起这一历史使命，原创人生、医学理论体系（4f肿瘤fbb癌症yuw

22、3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff）灵魂医学 soul medicine应运而生，她不但从宏观上或战略上圆满解释并解决了存在于人类医学及人文社会科学史上的一切疑难模糊问题，而且还能够使人们得以启迪人生（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh），不得不重新认识人类自身、不得不重新认识人类赖以生存的这个多维世界。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 医学化验医学定义（medicine），是处理人健康定义中人的生理处于良好状态相关问题的一种科学，以治疗预防生理疾病和提高人体生理机体健康为目的（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）狭义的医学只（df肺2

23、5s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）是疾病的治疗和机体有效功能的极限恢复，广义的医学还包括中国养生学和由此衍生的西方的营养学。现在世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）医学的科学性在与应用基础医学的理论不断完善和实践的验证，（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）例如生化、生理、微生物学、解剖、病理学、药理学、统计学、流行病学，中医学及中医技能等，来治疗疾病与促进健康。虽然东西方由于思维方式的不同导致研究人体健康与外界联系及病理机制的宏观微观顺序不同，但在不远的将来中西医实践的

24、丰富经验的积累和理论的（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）形成必将诞生新的医学-人类医学。 不同于现代医学，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）不同于传统中医， 金水医学诞生了，金水医学是以驱除病理，恢复生理为主张的全新医学，走出了人类医学的误区，（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff）治疗疾病的特色鲜明，不论是任何疾病都能做到从危为安，由重到轻的恢复办法。金水医学认识到人体是生命体，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）生命体有自己的强大的生理自我愈合功能，帮助生命体恢复自主作用才是治疗疾病的根本。

25、针对当今现代文明病，现代疑难病，现代慢性病，亚健康，一体多病，取得了巨大的成功，治疗法则为“胃肠洁，气血流，玄府开，营卫昌”人生命体运动符合自然节律，最终达到人体生理增强，消灭疾病的目的。编辑本段医学的分类 医学研究医学可分为现代医学（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）（即通常说的西医学）和传统医学（包括中医学、藏医学、蒙医学等）多种医学体系。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）不同地区和民族都有相应的一些医学体系，宗旨和目的不相同。印度传统医学系统也被认为很发达。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） 研究领域大方向包

26、括基础医学、临床医学、检验医学、预防医学、保健医学、康复医学等。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）基础医学包括：医学生物数学, 医学生物化学, 医学生物物理学 ,人体解剖学, 医学细胞生物学 ,人体生理学, 人体组织学 ,人体胚胎学, 医学遗传学, 人体免疫学, 医学寄生虫学, 医学微生物学 ,医学病毒学, 人体病理学 ,病理生理学, 药理学, 医学实验动物学, 医学心理学, 生物医学工程学 ,医学信息学, 急救学, 护病学, 新中心法则。 临床医学包括： 临床诊断学 实验诊断学.影像诊断学+ 放射诊断学+ 超声诊断学（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）

27、 + 核医诊断学* 临床治疗学 职能治疗学 化学治疗学 生物治疗学 血液治疗学 组织器官治疗学 饮食治疗学 物理治疗学（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 语言治疗学 心理治疗学 内科学 外科学 泌尿科学 妇产科学 （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）儿科学 老年医学 眼科学 耳鼻喉科学 口腔医学 传染病学 皮肤医学 神经医学 精神病学 肿瘤医学 急诊医学 麻醉学 护理学 家庭医学 性医学 临终关怀学（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 康复医学 保健医学 听力学。编辑本段医学的起源 手术治疗中、西医学的起源大致相同。主要包括：救护、求食的本能行为。如动物受伤会舐其伤口、遇热会避入水中，人与动物一样有着本能救护。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）人类的求食本能在寻找食物时，逐渐发现了葱、姜、蒜、粳米、薏米等虽为食物（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）或调味品，却具有治病作用；生活经验创造了医学。先古人类通过劳动制造出利器，从而产