《陈新-生理科学实验教学资料》2a班-陈新-实验22

1、专业：临床医学（七年制） 姓名： 陈新学号：3090103916实验报告日期：2012年4月5 fi地点：庚学院教学楼c座课程名称：生理科学实验实验类型： 动物实验 实验名称：离子与药物对离体蟾蛉心脏活动的影响 同组学生姓名： 黄婷沈童指导老师： 陆源离子与药物对离体蟾赊心脏活动的影响陈新 沈童黄婷（浙江大学医学院生理科学实验2a笫8组，浙江 杭州310058）摘要目的：了解离体心脏灌流的方法，观察钾、钙离子浓度、肾上腺素、乙酰胆碱对离 体蟾蛛心脏活动的影响并探讨作用机制。方法：对蟾蛛进行心脏离体手术，在离体心脏灌流 液屮依次加入所需溶液或药物，观察并记录相应心搏曲线。结果：使用无钙任氏液后平

2、均静 止张力为0.69±0.26g,平均发展张力为3.15±1.50go再加cacl?溶液，记录平均静止张力 为0.76土0.27g,平均发展张力为1.48±0.55go处理前静止张力显著小于处理后（p<0.05）o 处理前发展张力显著大于处理后（pv0.01）。洗脱后加任氏液，平均静止张力为0.66±0.22g, 平均发展张力为3.41±1.69g。再加cacl2溶液，平均静止张力为0.61±0.20g,平均发展张 力为4.89±1.59go处理前静止张力显著大于处理后（pv0.05）。处理前发展张力显著小于处 理后

3、（p<0.01）o洗脱后加任氏液，平均静止张力为0.62±0.19g,平均发展张力为3.30±1.73go 再加kc1溶液，平均静止张力为0.77±0.22g,平均发展张力为1.41±0.55g。处理前静止张 力显著小于处理后（pv0.01）。处理前发展张力显著小于处理后（pvo.oi）。洗脱后加任氏液, 平均发展张力为2.99±1.62go再加乙酰胆碱溶液，平均发展张力为2.01±0.96go处理前发 展张力显著大于处理后（pv0.01）。再加阿托品，平均静止张力为0.49±0.21g,平均发展张 力为2.93

4、77;1.54go处理前静止张力显著小于处理后（pv0.05）。处理前发展张力显著大于处 理后（pvo.ol）。洗脱后加任氏液，平均静止张力为0.51±0.19g,平均发展张力为2.78±1.49g0 再加肾上腺素溶液，平均静止张力为0.45±0.19g,平均发展张力为6.37±2.89o处理前静止 张力显著大于处理后（pv0.01）。处理前发展张力显著小于处理后（pvo.ol）。洗脱后加任氏 液，平均发展张力为2.33±1.14g,平均心率为30.00±6.11次/min。再加普荼洛尔溶液，平 均发展张力为1.99±1.0

5、1g,平均心率为27.60±6.52次/min。处理前发展张力显著小于处理 后（pv0.01）。处理前心率显著慢于处理后心率（p<0.01）o结论：，细胞外钠、钾及钙等离 子浓度的改变，影响对心肌细胞的生理电活动和生理特性，从而改变心肌细胞的兴奋性、自律性、传导性和收缩性。kc1、普奈洛尔和乙酰胆碱对心肌收缩起抑制作用。cacl2和肾上 腺素对心肌收缩起兴奋作用。关键词蟾赊；离体心脏；肾上腺素；乙酰胆碱；普荼洛尔；阿托品静脉窦未受损的离体蛙心在适宜的坏境中，能保持节律性兴奋和收缩活动一段时间。心 脏离体后，脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响，所以可以通过改变灌流液的

6、某些成分，可以观察到其对心脏活动的作用。灌流液中钠、钾离子浓度，是否含有某些激素 等因素都可通过相应机制作用于心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性和收缩性。1材料和方法1. 1实验动物 蟾赊10只(中华蟾蛛指名亚种，zhuoshan toad)1. 2 试剂肾上腺素(adrenaline hydrochloride),乙酰胆碱(acetylcholine chloride), 普蔡洛尔(propranolol hydrochloride),阿托品(atropine sulfate ),氯化钾，氯化 钙,任氏液(ringer' s solution)。1.3器材rm6240多道生理信号采集处

7、理系统(成都仪器厂),jzj01张力换能器(成都仪器 厂)14离体蛙心制备 取蟾赊破坏脑和脊髓，仰卧固定在蛙板上，从剑突下将胸部皮肤向上剪 开，剪除胸骨，打开心包，暴露心脏，分离左、右主动脉。在左主动脉下方穿线，靠头端结 扎作插管时牵引用，在主动脉干下方穿线，在动脉圆锥上方系松结，用于结扎固定蛙心插管。 用玻璃分针抬高心脏，用线在静脉窦与腔静脉交界处进行结扎，结扎线下压，以免伤及静脉 窦。用眼科剪在松结上方左主动脉根部剪一小斜口，将盛有少许任氏液的大小适宜的蛙心插 管由此切口处插入动脉圆锥。当插管头到达动脉圆锥时，用钱子夹住动脉圆锥少许，将插管 稍稍后退，并转向心室中央方向，蹑子向插管的平行方

8、向提拉，心室收缩期时将插管插入心 室，后将预先准备好的松结扎紧，在蛙心插管的侧钩上打结固定。剪断主动脉左右分支、腔 静脉及周禺结缔组织。用新鲜的任氏液反复换洗蛙心插管内的含血任氏液，直至蛙心插管内 无血液残留为止。1.5仪器连接 将蛙心插管固定在铁支架上，在心室舒张期使用蛙心夹夹住心尖，并将蛙心 夹的线头连至张力换能器的应变梁上，张力换能器输出线接微机生物信号处理系统第1通道 调节蛙心舒张期张力至lg并待其稳定。1.6参数设置rm6240系统:通道时间常数为直流，滤波频率30hz,灵敏度7. 5g,采样频 率800hz,扫描速度5s/divo1.7试剂对离体蛙心的作用1.7. 1向插管中加入5

9、1任氏液，心搏曲线稳定后，记录正常的心搏曲线45s。加任氏液25 u 1,稳定45s后。1.7.2使用无钙任氏液1ml替换插管内的任氏液，心搏曲线稳定后，记录曲线45s。再加 0. 045mol/l cacl2溶液 25 ul,稳定 45s 后冲洗。1. 7. 3用任氏液洗脱3次，加入lml任氏液，待曲线稳定45s后，在灌流液中加0. 045mol/l cacl溶液25 pl,心搏曲线稳定后，记录曲线45s。1.7.4用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入lml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏 液中加0.2 mol/l kc1溶液20 ul,心搏曲线稳定后，记录曲线45s。1.7.5用任氏液

10、换洗数次，加入51任氏液，待曲线稳定后，记录曲线45s,在任氏液中加 6x10-6 mol/l的乙酰胆碱(ach)溶液15ul,心搏曲线稳定后，再加2x10-4 mol/l阿托 品(atr) 15 m 1,心搏曲线稳定后，记录曲线45s。1.7.6用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入lml任氏液，待曲线稳定45s后，在任氏 液屮加6x10 5 mol/l的肾上腺素(adr)溶液10ul,心搏曲线稳定后，记录曲线45s。1.7.7用任氏液洗脱数次，收缩曲线基本恢复后，加入lml任氏液，待曲线稳定45s后，在 任氏液中加5x10-1 mol/l普蔡洛尔(pro)溶液10ul,心搏曲线稳定后,再加

11、入6x10-5 mol/l 的adr溶液10 u 1,心搏曲线稳定后,记录曲线45s。1. 8数据处理 测量各项处理前后的心率(heart rate,hr)，心脏舒张末张力(ond diastol ic tension, edt),心脏收缩末期张力(end systolic tension, est)。数据用 excel 统计, 结果用£±s表示，并用t-test进行显著性检验，p<0. 05表示差异显著，图表用spss处 理。2结果2. 1向插管屮加入lml任氏液，记录平均静止张力为0. 75±0. 19g,平均发展张力为3. 19 ±1.66g

12、,平均心率为30. 10±6.81次/min。加任氏液2510,记录平均静止张力为0. 74±0. 20g,平均发展张力为3.27±1.57g,平均心率为30. 80±6. 37次/min。平均静止张力与 发展张力在处理前后无显著性差异(p>0.05)。2. 2用无钙任氏液lml替换插管内的任氏液，记录平均静止张力为0.69±0.26g,平均发展 张力为 3. 15±1. 50g,平均心率为 30. 40±6. 47 次/mine 再加 0. 045mol/l cacl?溶液 25 ul, 记录平均静止张力为0. 76

13、±0. 27g,平均发展张力为1. 48±0. 55g,平均心率为30. 30±6. 24 次/mine处理前静止张力显著小于处理后（p0.05）。处理前发展张力显著大于处理后 （p0. 01）。2.3用任氏液洗脱3次，加入lml任氏液，记录平均静止张力为0.66±0.22g,平均发展张 力为3. 41±1.69g,平均心率为31.67±6. 20次/min。在灌流液中加0. 045mol/l cacl2溶 液25 ul,记录平均静止张力为0.61±0. 20g,平均发展张力为4. 89±1.59g,平均心率为 3

14、0. 56±6. 67次/min。处理前静止张力显著大于处理后（p0.05）。处理前发展张力显著小 于处理后（p<0.01）。2.4用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入lml任氏液，记录平均静止张力为0. 62±0. 19g,平均发展张力为3.30±1.73g,平均心率为31.63±6. 44次/min。在任氏液中加0.2 mol/l kc1溶液20ul,记录平均静止张力为0. 77±0. 22g,平均发展张力为1.41±0. 55g, 平均心率为30. 50±6. 59次/min。处理前静止张力显著小于处理后（p0

15、01）。处理前发展 张力显著小于处理后（p<0.01）。2. 5用任氏液换洗数次，加入lml任氏液，记录平均静止张力为0. 56±0. 17g,平均发展张 力为2.99±l62g,平均心率为31.00±7. 07次/min。在任氏液中加6x10 6 mol/l的乙酰 胆碱（ach）溶液15u1,记录平均静止张力为058±019g,平均发展张力为201±0.96g, 平均心率为30. 75±5.52次/min。处理前静止张力与处理后无显著性差异（p>0.05）。处理 前发展张力显著大于处理后（p<0.01）o再加2x1

16、0_4mol/l阿托品（atr） 15p1,心搏曲线 稳定后，记录平均静止张力为0. 49±0. 21g,平均发展张力为2.93±1. 54g,平均心率为30. 00 ±6. 37次/min。处理前静止张力显著小于处理后（1）0.05）。处理前发展张力显著大于处理 后（p<0.01）o2.6用任氏液洗脱数次，曲线基本恢复后，加入lml任氏液，记录平均静止张力为0.51± 0. 19g,平均发展张力为2. 78±1. 49g,平均心率为28. 44±9. 42次/min。在任氏液中加6x10-5 mol/l的肾上腺素（adr）溶液

17、10p1,记录平均静止张力为0. 45±0. 19g,平均发展张力为 6. 37±2. 89,平均心率为28. 33±9. 54次/min。处理前静止张力显著大于处理后（p<0.01）o 处理前发展张力显著小于处理后（p001）。2.7用任氏液洗脱数次，收缩曲线基本恢复后，加入lml任氏液，记录平均静止张力为0.46 ±0.21g,平均发展张力为2. 33±1. 14g,平均心率为30. 00±6, 11次/min。在任氏液中加 5x104 mol/l普蔡洛尔（pro）溶液10»1,心搏曲线稳定后，记录平均静止张力为0

18、. 44 ±0. 19g,平均发展张力为1.99±1.01g,平均心率为27. 60±6. 52次/min。处理前静止张力处理后无显著性差异（1）>0.05）。处理前发展张力显著小于处理后（p0.01）。处理前心率 显著慢于处理后心率（p<0.01）o再加入6x10'5mol/l的adr溶液10ul,记录平均静止张 力为0.43±0. 20g,平均发展张力为1.92±1. 10g,平均心率为26. 10±7. 05次/min。处理 前后的静止张力、发展张力及心率均无显著差异（p>0.05）。表1药物对蟾赊离体

19、心脏的影响实验项目样本-数静止张力（q发展张力(g)心率(bpm)处理前处理后处理前处理后处理前处理后0. 69 ±0. 76 ±3. 15±1.48±30. 40±30. 30 ±无钙100. 260. 27*1. 500. 55*6. 476. 240. 66 ±0. 61±3.41±4. 89 ±31.67±30. 56 ±高钙90.220. 201.691. 59*6. 206. 670. 62 ±0. 77 ±3. 30 ±1.41&#

20、177;31.63±30. 50 ±高钾80. 190. 22"1. 730. 55*6. 446. 590. 56±0. 58 ±2. 99±2.01±31.00±30. 75 ±乙酰胆碱80. 170. 191.620. 96"7. 075. 52阿托品+乙80. 58 ±0.49±2.01±2. 93 ±30. 75 ±30. 00 ±酰胆碱0. 190.210. 961. 54*5. 526. 370. 51±0.45

21、±2. 78 ±6. 37±2& 44 土28. 33 ±肾上腺素90. 190. 19"1.492. 89*9. 429. 540. 46 ±0.44±2. 33±1.99±30. 00 ±27. 60 ±普蔡洛尔100.21g0. 191. 14l.of*6. 116. 52"普蔡洛尔+100. 43 ±0. 43 ±1.93±1.92±27. 20 ±26. 10±肾上腺素0. 190. 201. 10

22、1. 107.217. 05*： p<0. 05vs.处理前。*： p<0. olvs.处理前。3讨论3.1实验结果分析及结论在心肌收缩过程中，细胞外的作用相当重要。与骨骼肌细胞不同，心肌细胞肌质网 不十分发达，cf储量较少，收缩过程中依赖细胞外液c内流。心肌兴奋收缩耦联所需 屮80%-90%来自终末池，10%-20%来自细胞外液，胞质内cf浓度升高约100倍时，触发心肌 细胞收缩。心肌细胞兴奋时，动作电位使钙耦联位点上的横管膜去极化，电压门控性l型 通道(lcc)开放,胞外c/内流产生钙小星，其作用于肌质网终池膜上雷诺丁受体2(ryr2) 使英开放，终池中c屮流入胞质形成钙火花，

23、构成钙诱导钙释放机制(cicr)。由此引发的 钙瞬变使c/与邻近肌钙蛋白结合，肌节收缩。本实验中，使用无钙任氏液灌流离体蛙心后，再加入c&c12溶液，造成胞外低环境, c对站内流的竞争性抑制膜屏障作用减弱，阈电位水平下移，心肌兴奋性增高，。动作电 位中，第2期1心通道内流减少，动作电位时程、不应期和平台期均延长，造成实验中观察 到的心肌静止张力增大、发展张力减小的现象。使用用含钙任氏液灌流离体蛙心后，再加入 cac12溶液，致使细胞外液浓度较高，c/对快钠通道的屏障作用加强，阈电位水平上移, 心肌兴奋性降低，动作电位中，第2期la l通道内流增加，钙依赖性钾流ik©被激活，动

24、作 电位时程、不应期和平台期均缩短，造成实验中观察到的心肌静止张力减小、发展张力增大 的现象。心肌细胞的静息电位主要来自f跨膜扩散形成的电-化学平衡电位，细胞内外k浓度差 的变化会影响静息电位的水平。本实验中，用任氏液灌流离体蛙心后，再加入kc1溶液，致 使细胞外液q升高，为达到电化学平衡，静息电位减小接近阈电位，动作电位产生后复极化 加快，心肌舒张不完全，动作电位吋程缩短，造成实验中观察到的心肌静止张力上升、发 展张力下降的现彖。乙酰胆碱作为迷走神经末梢释放的神经递质，能作用于心内神经节的节后神经元膜上的 n1型胆碱能受体，支配窦房结、心房肌、房室交界、房室朿及其分支，作用于心肌细胞膜 上m

25、型胆碱能受体，通过激活g蛋白等一系列信号传导通路，抑制腺昔酸环化酶，降低细胞 内的camp水平及pka活性，引起心肌细胞的负向变力、变时、变传导作用。本实验中， 在离体蛙心灌流液屮加入乙酰胆碱，致使窦房结自主节律细胞p细胞4期if减小，心率减 慢，并产生负向变力作用，造成实验屮观察到心肌发展张力下降的现象。阿托品是对m胆碱 受体具有高选择性的乙酰胆碱竞争性拮抗剂，结合于细胞膜上受体7个跨膜螺旋结构所产生 的裂隙中，解除迷走神经递质乙酰胆碱対于心脏活动的抑制作用。本实验中，离体心脏用 加入乙酰胆碱的灌流液处理后，再加入阿托品，可观察到心肌肌力发生显著冋升。肾上腺素与去甲肾上腺素结构相近，可作用于

26、心肌细胞膜上的b1受体，通过g蛋白- 腺背酸环化酶-camp途径，使心肌细胞内camp水平上升，激活pka,细胞内一系列功能蛋白 磷酸化，引起心肌细胞的正向变力、变吋、变传导效应。本实验中，在离体蛙心的灌流液 中加入肾上腺素后，心肌收缩力增强c普蔡洛尔这一药物中的左旋体具有阻断b受体的作用，用药后可使心率减慢，心肌收缩 力及心排出量降低。本实验中，在离体蛙心灌流液中加入普蔡洛尔，可观察到发展张力显 著下降，心率显著下降。此后再加入肾上腺素，观察普蔡洛尔阻断后到正向变力、变吋、变 传导效应被消除。3.2实验中的异常、不足及改进方法本实验中部分实验组在制作离体蛙心过程中损伤静脉窦，造成离体蛙心起搏

27、点改变，心 率等相关指标均发生变化，影响实验效果。本实验设计过程屮，在任氏液中加入了肾上腺素并观察其作用效果，然后更换新的任氏 液，加入了普蔡洛尔，观察其作用效果后，再次加入肾上腺素，以上步骤的设计初衷应该是 为了了解普蔡洛尔对肾上腺素的阻断作用以及上述两种药物各自对心脏产生的作用。按照上 述实验操作可以很好的观察到肾上腺素和普茶洛尔各自对心脏的作用，但对于观察普茶洛尔 对肾上腺素的阻断作用的设计并不严谨。依照本实验的数据进行分析，肾上腺素组处理前静止张力显著大于处理后，处理前发展 张力显著小于处理后。普蔡洛尔+肾上腺素组的静止张力、发展张力及心率与处理前均不具 有显著性差异。在统计学中，具有

28、显著性差异是用统讣学意义的，而不具有显著性并没有与 显著性相反的统计学意义，这就表明，从统计学的角度讲，普荼洛尔+肾上腺素组的静止张 力、发展张力及心率与处理前均不具有显著性差异并不代表它抑制了肾上腺素的作用。而肾 上腺素组和普荼洛尔+肾上腺素组在实验过程屮更换了任氏液，可视为非处理因素的改变， 不能进行组间数据的t检验，所以不能很严谨地观察到普蔡洛尔对肾上腺素的阻断作用。如将实验改为先加入肾上腺素，待产生作用后加入普蔡洛尔进行观察，由于肾上腺素和 普茶洛尔的作用吋间的差界，难以验证实验现象是普荼洛尔的阻断作用还是肾上腺素的作用 消退造成的。如选用另一种作用效果更迅速的肾上腺素受体阻断剂进行实

29、验，可能可以取得 更好更严谨的实验结果。参考文献1 陆源，夏强.生理科学实验m.杭州：浙江大学出版社.2004. 267页2 姚泰.生理学m北京:人民卫生出版社.2005. 123-124页,140-157页，182-185页3 杨世杰.药理学m.北京：人民卫生出版社.2010. 70-72页,81-84页附录 原始数据: 附表 1 effects of adrenaline, aceytlcholine, potassium and calcium ions on isolatedtoad heartcontrolperfusioncontrolperfusioncontrolperfusi

30、on10.510. 561.221.2626. 0027.0020. 790. 802.402.4139. 0038. 0030. 730. 702. 222.662& 0029. 0025|1l ringer" s solution40. 680. 672.512. 7527.0029. 0050. 730. 743. 363.8030. 0030. 0060. 490. 492. 792.4325. 0026. 0071.030. 993. 193.0738. 0038. 0080. 570. 484. 144.0126. 0027. 0090.940.917. 377.

31、 1841.0042. 00101.001.052. 723. 1121.0022.0010. 560.611.260.9127.0027. 00ca2+20. 790. 802.401.4239. 0032.00-free30. 710. 692.851.2827.0025. 00ringer" s solution40. 660. 643. 041.262& 0029. 0050. 730. 773. 622.4830. 0031.0060.470. 552. 230.9125.0025. 0070.991.243. 071.553& 0035. 00groups

32、 samperend diastolic tension(g)end systolic tension(g)hr (bpm)89100. 110.860.980. 300. 971.022.997. 023. 050. 972. 261.7526. 0041.0023.0036. 0042. 0021.0010. 550. 521.222.8927.0025. 00290. 660. 632.664. 0636. 0034. 00ca2+ 22o40. 590. 532.893.9629. 0030. 00x 10_4m50. 560. 574. 255. 1931.0031.00ringer

33、，s60. 500. 432. 595. 302& 0028. 00solution70.950. 783. 304. 823& 0034. 0080. 300.314. 006. 1434. 0033. 0090.890. 867. 24& 1841.0042. 00100. 940. 892. 553.4921.0018. 0010.510. 571.281.0425. 0024. 00290.610. 752. 500. 7936. 0034. 00k+ 5.9u40.680. 712. 591.9129. 0030. 00x 10_3m50. 540. 874.

34、 571.2730. 0030. 00ringer" s60. 440. 631.640. 7522.0021.00solution70. 941. 163.441.4234. 0030. 0080.410. 483.692. 1535. 0032. 0090.840. 966. 651.9742.0043. 001010.440. 471.260. 9526. 0026. 002q0.620. 641.821.6731.0032. 0040.630. 642.201. 7230. 0030. 0050.400.414. 592.9831.0033. 00aln60. 360. 401.671. 1018. 0021.0070. 800. 923.211.6336. 0032.0080.440.413. 162. 2634. 0032. 0090. 750. 755. 993. 7942.0040. 001010.470.420. 951.3426. 0022. 002q0. 6