《陈新-生理科学实验教学资料》创新性实验项目申报书-2a班-余望舒

1、项目编号：c0000000001浙江大学医学本科生创新性实验设计申报书项目名称：川茸嗪与环磷酰胺合用治疗lewis肺癌的增效减毒作用主持人：沈童团队成员：余望舒所在年级专业：临床医学09级所在实验班：生理科学实验2a班指导教师：陈玮琳联系电话613997电子由卩箱： 3090103909z ju. edu. cn填报日期：2012. 5.9浙江大学基础医学系二o二年五月制一、项目成员情况简表项 目 简 况项目名称川穹嗪与环磷酰胺合用治疗lewis肺癌研究增效减毒作用起止年月2012年5月-2012年6月项 目姓名沈童性别男出生年月1991.9主持人家庭所在省市县浙江省

2、杭州市富阳父亲/母亲职业/修读过 与科研 有关的 课程或 学术活 动时间课程名称学时兴趣程度（高、 屮、低）2009普通生物学4高2010基础医学导论4中参加科 技活动、教 师科研 与获表学术 论文情 况时间研究项目、获奖名称或论文题目项冃、获奖级别或 杂志名称/有机会让你主持一项创新性实验项目的延伸，你会怎么做：首先要有创新思维，在延伸方向中找出可能出成果而又少有前人涉及的领域，然后大量查找文献分析该延伸方向的可行性，明确各人分工，设计实验最佳方案。各方面因素都要考虑周到，如资金、设备和实验人员积极性等。充分发挥想象力和领导力，实验过程中力求完善，操作准确。项 目 参 与 人姓名性别出生年月

3、专业分工吴靖邦男1991.2临床医学细胞培养，答辩陈新男1990.12临床医学细胞培养，答辩余望舒女1991.6临床医学细胞培养，体外实验滕琦蓿女1991.10临床医学细胞培养，体外实验黄婷女1991.8临床医学试剂配置，荷瘤张聪男1990.11临床医学体内实验王掰妍女1990.6临床医学解剖观察，测定观察指标黄予怀1986.10临床医学解剖观察，测定观察指标陈丹丹女1991.5临床医学试剂配置，荷瘤祝铭男1990.4临床医学体内实验王宏侃男1990.12临床医学荷瘤，体内实验二、立项依据(项目的意义、研究现状、原创点、可行性分析、预期结果、工作基础)项目的意义：肺癌是近年来最常见的恶性肿瘤之

4、一，发病率和病死率很高。非小细胞肺癌 (nsclc)约占肺癌总数的8()%-85%,化疗是当前主要治疗措施。而作为我国特色的中 医药治疗，因其有效成分逐渐明确很受到世人的关注，目前较多见的是利用小鼠lewis 肺癌细胞进行重要抗癌作用的研究。川芬嗪是活血化瘀中药川芬中的一种生物碱单体， 具有显著抑制血管生成的作用山。本项冃旨在研究联合用药条件下，川芟嗪对环磷酰胺 的增效减毒的作用效果和最佳浓度。研究现状：1. 川芬嗪具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血再灌注损伤、降低血 压、降低肺动脉高压、抑制平滑肌细胞和成纤维细胞增殖以及抗实验性心律失常等 多种心血管药理作用，在临床上用于治疗心

5、血管疾病。2. 川芬嗪与化疗药物顺钳联用治疗小鼠lewis肺癌能够提高肿瘤抑制率，降低不良反 应，提高生活质量，其机制可能与下调p选择素的表达及抑制肿瘤内微血管生成有 关，并能降低毒副反应，提高生存质量。3. 腹腔注射川芬嗪注射液能够减少lewis肺癌肿瘤体积、重量和肺转移灶数，其作用 机制可能与抑制vegf的表达，降低肿瘤微血管密度有关。4. 腹腔注射川芬嗪注射液能够减少lewis肺癌肿瘤体积、重量和肺转移病灶数，其 作用机制可能与抑制vegf的表达，降低肿瘤微血管密度有关。5. 环磷酰胺是临床上治疗肿瘤的常用化疗药物，但是在临床应用中毒副作用明显，最 主要的副作用为骨髓抑制，表现为白细胞和

6、血小板减少以及贫血。原创点：it前述未发现有过川芬嗪联合环磷酰胺治疗小鼠lewis肺癌的相关研究；基本没有 体外实验的相关文献，本实验有望找到lewis m癌的新疗法。可行性分析：实验技术方面，校方提供安全可靠的实验用品及实验条件，体外实验和体内实验技 术已经比较成熟、有效。从实验成本上看，川芬嗪为常用中药单体，联合用药的药物环磷酰胺是常用的化疗药，故实验成本在可承受范围内。此外，本项目选择的动物模型均为经典的小鼠lewis皮下接种肺癌模型，体外实验 结果由mtt法测定，可操作性很强。实验由12位同学于五周内完成，人员和时间都比 较充足。预期结果：体内实验，腹腔注射联合用药的小鼠相对于注射生理

7、盐水的小鼠，对lewis肺癌的 生长有明显的抑制作用，联合用药小鼠的外周血白细胞数和骨髓有核细胞数显著多于单 纯注射环磷酰胺的小鼠；体外实验，通过mtt法可以检测出，在川茸嗪的作用下，体 外培养的3ll细胞的生长、增殖被抑制。工作基础：通过查阅文献，已经对药物以及小鼠的lewis肺癌有一定的了解，并且已经获得 lewis肺癌的细胞系进行培养。了解环磷酰胺和川茸嗪的药物结构和简单作用机理，并 且已经获得校方设备和资金的支持。参考文献：1 杨洋，徐晓玉.中药有效成分治疗lewis肺癌的研究进展.中华肺部疾病杂志(电 子版).2010;3(6):312 张隽，曹培国，符慧群，唐又群，潘宇亮.川苛嗪联

8、合顺钳治疗lewis肺癌的实验 研究.医学临床研究.2006;23(8) : 1249-51.3 符慧群，唐雪元，潘宇亮.川苛嗪和顺钳联用对小鼠lewis肺癌生长和转移的抑制 作用.南华大学学报：医学版.2008;36(1):46-9.4 王文武等.川苛嗪对小鼠lewis肺癌的治疗作用j.中国临床药理学与治疗学，2005,10 (4)： 421-4235 陈刚等川苛嗪和丹参对小鼠lewis肺癌生长的抑制作用与抑制血管生成的关系j中 草药,2004,35 (3)： 296.6 复方乌骨藤胶囊与环磷酰胺合用治疗lewis肺癌研究增效减毒作用a.陕西医学杂志 第39卷第11期.2010. 11三、实

9、验设计(实验对象、实验分组、实验方法、观察指标、统计分析等) 实验对象：c57小鼠实验分组：体外实验组6组，每组5个复孔体内实验组4组，每组10只小鼠实验方法：体外实验方法(mtt)1、3ll细胞悬液的制备：用1640完全培养基配成所需浓度10的细胞悬液。2、细胞悬液于6孔板培养，共培养2板°细胞贴壁后分别加药物：50ug/ml川尊嗪+20ug/ml 环磷酰胺，looug/ml川茸嗪+20ug/ml环磷酰胺,200ug/ml川苛嗪+20ug/ml环磷酰胺， 300ug/ml川茸嗪参考文献： 戚晓敏，单根法，张辅贤，钟兹，谢晓宇，李国庆.川時嗪逆转肺癌细胞株多药耐药性 的研究.上海第二

10、医科大学学报.2003;23(b10):31-3. 王文武，戴西湖，欧阳学农川茸嗪对小鼠lewis肺癌的治疗作用.中国临床药理学与 治疗学.2005; 10(4) : 421-3.+20ug/ml环磷酰胺；100ug/ml环磷酰胺；50ul生理盐水。3、孵育4、测0d值体内实验方法接种：c57小鼠皮下接种3ll肺癌细胞，造成小鼠的肺癌模型。分组：将小鼠随机分为4组，每组10只，其中2组为联合用药组，1个环磷酰胺组、1个 生理盐水组。给药：小鼠接种lewis肺癌细胞后第二天开始给药，4组给药方式分别为：每天一次腹腔注 射川与嗪50mg/kg+环磷酰胺20mg/kg；每天一次腹腔注射川苛嗪100i

11、ng/kg+环磷酰胺 20mg/kg；每天一次腹腔注射环磷酰胺100mg/kgc2；每天一次腹腔注射生理盐水0. 05ml/go 观察指标：取皮下肿块称质量，计算肿瘤抑制率，取双侧肺称质量，并计数各肺叶表面的癌转移灶数。观察胸腺、脾以及肺。计数肺部表而转移结节，计算肺表面结节转移抑制率。计数股骨屮骨髓有核细胞数。统计分析：用spss统计学软件处理数据，结杲以x ±s表示。组间进行t检验，比较结果有无统计学 意义。四、实施方案及计戈u （实验室要求；仪器设备、实验对象、药品试剂、实验材料计划; 实验步骤；数据采集与统计等）实验室要求：有完整的细胞培养设备，较高情结级的动物实验区，二级生

12、物实验室仪器设备：thermo恒温细胞培养箱,a1rtech超净台,酶标仪,olympus ckx41倒置显微镜，超速离 心机实验对彖：c57小鼠，3ll肺癌细胞药品试剂：川茸嗪（粉末）,1640完全培养基,生理盐水，环磷酰胺，dmso, mtt实验材料计划：仪器由生理科学实验室提供，药品及实验小鼠向相应公司购买实验步骤：1. 体外实验方法（mtt）1）.3ll细胞悬液的制备：先弃培养基，加2ml胰酶，消化1-3分钟，再加含血清的培养基8ml,吹下细胞，收 集到离心管，1500rpni离心5分蚀，弃去上清；加入1640完全培养基配成所需浓度1（/的 细胞悬液。2）.细胞贴壁后加药物：分为6组，

13、每组设定5个复孔。分别为联合用药组a： 50ug/ml川莒嗪+20ug/ml环磷 酰胺；联合用药组b： 100ug/ml川茸嗪+20ug/ml环磷酰胺；联合用药组c： 200ug/ml川 茸嗪+20ug/ml环磷酰胺；联合用药组d： 300ug/ml川茸嗪+20ug/ml环磷酰胺；环磷酰胺组： 100ug/ml环磷酰胺；生理盐水组：生理盐水。将细胞悬液铺于96孔板，每孔150 ul,以 上每组设置5个复孔，贴壁生长24ho分别加入以上每组药物每孔50 u lo3）.孵育：二氧化碳培养箱孵育48小时后每孔加加10 ul mtt,继续孵育2小时。4）.测0d值：弃上清，加150u1二甲亚飒（dms

14、o）,振荡10min,以自动酶标仪比色,波长490nm, 得到每孔0d值。2. 体内实验1）.接种：c57小鼠采用皮下接种法，对小鼠左侧腋下皮肤进行酒精消毒，以iml注射器 将上述实验所得2x106个细胞溶于0.2讯生理盐水，制成细胞悬液注入小鼠左侧腋下，稍 停针后拔针。2) .分组：将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为联合用药组a、联合用药组b、环磷酰 胺组、生理盐水组。3) .给药：小鼠接种lewis肺癌细胞后笫二天开始给药。联合用药组a：每天一次腹腔注射 川茸嗪50mg/kg+环磷酰胺20mg/kg;联合用药组b：每天一次腹腔注射川茸嗪100mg/kg+环 磷酰胺20mg/kg；环磷酰

15、胺组：每天一次腹腔注射环磷酰胺100mg/kg;生理盐水组：每天 一次腹腔注射生理盐水0. 05ml/go4) .检测：接种前和接种后每3d称1次体重，按体重变化调整给药，笫15天脱颈椎处死小鼠， 取皮下肿块称质量，计算肿瘤抑制率，取双侧肺称质量，并计数各肺叶表面的癌转移灶数。肿瘤生长抑制率二(生理盐水组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/生理盐水组平均瘤 质量x100%。末次给药后次日，自小鼠内眦静脉丛采血，取血20j加入到2ml2%冰醋酸溶液屮摇 匀，常规计数外周血白细胞总数。称体重后处死小鼠，剖胸观察其双肺表面肿瘤转移情况，计数肺部表面转移结节，计 算肺表面结节转移抑制率，取双侧肺称质量。剖取瘤块称重，计算抑