藻类及其危害和监测-培训资料

1、一、蓝藻 蓝藻(bluealgae)又名蓝细菌(Cyanobacteria)、蓝绿藻(bluegreenalgae)。是一类进化历史悠久、革兰氏阴性、无鞭毛、含叶绿素a、不形成叶绿体、能进行产氧性光合作用的原核生物。蓝藻在自然界中分布极为广泛，现知的2000多种蓝藻分布在各种大小的淡水水体、海洋水体、盐泽地、高山冰川等。蓝藻还能和动物共生，如地衣、满江红和苏铁属的一些块根中、淡水中的跟足类动物体中都有共生蓝藻。常于夏季大量繁殖。腐败死亡后在水面形成一层蓝绿色而有腥臭味的浮沫。 按照蓝藻(Cyanobacteria)的形态和结构特征，分类为两纲：色球藻纲和藻殖段纲。已知蓝藻约2000种，形成水华

2、的蓝藻有十多个属，主要有色球藻属(Chroococcus)、颤藻属(Oscillatoria)、鱼腥藻属(Anabaena)、微囊藻属 ( Microcystis)。二、蓝藻的危害1水体富营养化 近年来，随着经济的快速发展以及人口的增长，出现了一系列的环境问题，其中的水污染问题日益严重，受到人们普遍关注的就是水体富营养化。所谓水体的富营养化，就是指河流，湖泊等水体，接受来自外界的N，P等植物性营养元素过多，逐渐累积而形成一个营养元素非常丰富的状态。富营养化是水体的自然衰老过程，在自然情况下，水体也会发生富营养化这一过程，只不过在自然情况下该过程非常缓慢。近年来，随着人类活动的影响，工农业废水，

3、生活污水的排放，越来越多的N、P等植物性营养不断的输入到水体中，加速了富营养化的形成，这个就称之为人为富营养化。水体的富营养化已经成为一个世界性的环境问题，由于水体的富营养化，营养元素大量积累于水体，当光照，温度，水体稳定性等适合藻类生长的时候，就会造成藻类和某些浮游生物大量繁殖，水质恶化，破坏了水体正常的生态系统。比如，藻类死亡分解后会消耗水中的氧气，使得水中的溶氧量下降造成大量鱼类死亡，水体透明度下降等。水体富营养化引起的藻类大量繁殖，聚集漂浮在水体表面形成水华(淡水)或赤潮(海洋)。其中的一些蓝藻类形成的水华，如铜绿微囊藻，水华束丝藻，鱼腥藻等，会释放一些有毒的化学物质，如神经毒素，肝毒

4、素等。这些毒素引发的水问题也越来越受到人们的关注，其中最重要的是由微囊藻释放的微囊藻毒素。微囊藻毒素主要是由淡水铜绿微囊藻释放，是蓝藻水华污染中出现频率最高，危害最为严重也是研究最多的藻毒素种类。根据报道，有毒藻类形成的水华或赤潮曾在多个国家或地区的沿海出现，欧洲，美洲，非洲，大洋洲，中东和亚洲等多个国家或地区都出现过有毒蓝藻水华，我国的广东沿海，昆明滇池，无锡太湖，武汉东湖等也都发生过程度不等的水华，而且有着越来越严重的趋势。这些富营养化带来的水华不仅影响水体的感官性状，更重要的是这些水体很多都是作为居民生活用水的来源，水华的发生不仅严重影响居民的正常生活，还会带来重大的经济损失。水体富营养

5、化会导致蓝藻的大面积爆发性繁殖。蓝藻的繁殖大多出现在夏秋温暖季节。当水温达到28以上时蓝藻便会快速生长，且高温天气持续越长。蓝藻生长的时间也越长。蓝藻的大量繁殖不仅会抑制其它藻类的生长。使水体的透明度下降还会向水体排放有毒的代谢物质。且大量的蓝藻死亡后会造成水体的溶解氧严重不足。产生恶臭。给生态环境和人类健康构成了严重的威胁。2水华水华(water bloom，又称水花 water flower)，是指在富营养化的淡水中，由于以原核生物蓝藻为主大量繁殖所致(当然也伴有少量真核的绿藻等)。主要的蓝藻有铜绿微藻、水花微囊藻、水花束丝藻、水花鱼腥藻等，它们的细胞内含叶绿素和蓝色素等，大量繁殖使水体变

6、蓝或形成其它颜色，并带有腥味或霉味。当蓝藻水华严重时水面形成厚厚的蓝绿色湖靛散发出难闻的气味不仅破坏了健康平衡的水生生态系统而且因藻细胞破裂后释放出了多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。2.1国内外水华污染状况目前世界上淡水湖泊蓝藻水华发生的频率与严重程度都呈现迅猛的增长趋势发生的地点遍布全球各地，欧洲非洲北美洲和南美洲分别有53%28%48%和41% 的湖泊存在不同程度的富营养化现象亚太地区54% 的湖泊处于富营养化状态 自1878年首次报道了动物由于饮用含蓝藻的水而死亡以来， 国内外因藻毒素引起的水生动物鸟类畜类甚至人类死亡的事件频繁发生， 天然水体富营养化已成为我国乃至世

7、界所面临的重大环境污染问题之一。在我国早在 20世纪60 年代太湖中就已经发现有蓝藻水华出现20 世纪80 年代初进行调查的34个湖泊中有一半以上的湖泊面积属于富营养化状态 90年代以来全国淡水水体的富营养化状况更加严重 60%的天然淡水湖泊有不同程度的富营养化污染现象 除了云南滇池江苏太湖和安徽巢湖三大淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华污染外 长江黄河中下游的许多湖泊和水库中也都相继发生了不同程度的蓝藻水华污染现象并检测到了藻毒素的存在 目前全国每年都有许多自来水厂因蓝藻暴发而造成的水源污染而被迫减产或停产 对市民的饮用水安全供给构成了越来越严重的威胁。2.2水华蓝藻代谢物蓝藻水华污染所带来的主要

8、危害是在有毒蓝藻细胞破裂后向水体中释放多种不同类型的代谢物。包括二甲基异莰醇(MIB)和土臭素（GSM），蓝藻毒素。2.2.1 MIB和GSM（结构如下图） MIB和GSM是导致水中土腥味和霉味的2种主要物质,这些物质在浓度极低（5-10ng/l）的情况下仍能被饮用者感觉到, 其嗅阈值分别为29 mg/L和10mg/L。这2种物质是蓝藻(鱼腥藻属、束丝藻属、浮丝藻属、 席藻属、 念珠藻属等)产生的次生代谢产物。 图1：MIB和GSM的结构式2.2.2蓝藻毒素目前已发现的蓝藻毒素有将近40种，主要包括作用于肝脏的肝毒素、作用于神经系统的神经毒素、位于细胞壁外层的脂多糖内毒素和引起炎症的皮肤毒素等

9、。 （1）肝毒素 在蓝藻毒素中，肝毒素是报道最多的一种。肝毒素主要包括微囊藻毒素、节球藻毒素及柱孢藻毒素等。此毒素由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、泡沫节球藻、明胶颤藻及念珠藻等产生。1）微囊藻毒素(MC)理化性质微囊藻毒素是由7个氨基酸组成的具有生物活性的单链环状多肽，一般结构为环，相对分子量为1000Da左右，结构下图。其中的X和Z是两个可变氨基酸，属于蛋白质氨基酸，另外五个是非蛋白质氨基酸。MC的命名就是根据这两个可变氨基酸而得来的，比如，最常见的形式是MCLR，其两个可变氨基酸就是亮氨酸(Leucine L)和精氨酸(Arginine R)。MC是两性化合物，结构中包含亲水基团(羧基、胍基)和

10、疏水基团(Adda残基)，它的7个组成氨基酸都能发生结构变异，但是最常见的变异发生在两个可变的蛋白质氨基酸以及Masp和Mdha残基的甲基化模式上。图2：MIB和GSM的结构式由于MC的结构变异，目前在淡水中发现的藻毒素有80多种异构体，最基本的形式有三种，分别是MC-LR，YR和RR其中MC-LR的毒性最大最为常见。MC是单链环状结构，性质比较稳定，易溶于水，甲醇，丙酮等溶剂，加热煮沸(水浴100，30min)不失活，抗pH变化，不易挥发，常规的自来水处理工艺如过滤，混凝，沉淀，加氯等都不能有效去除MC。毒性微囊藻毒素(MC)是淡水水体中危害最为严重的毒素种类，主要靶器官是肝脏。无论是经口还

11、是腹腔注射，都能出现肝脏病变。MC除了对肝脏有损伤之外，对生殖系统也有影响，有研究发现，暴露于MC可导致雄性大鼠生殖系统的损伤，如睾丸曲细精管萎缩、堵塞等。鉴于MC的危害，为了确保饮水安全，1998年，世界卫生组织提出了饮用水中MC-LR含量的最高允许含量为1ugL。我国在2005和2006年颁布执行的城市供水水质标准，生活饮用水卫生标准和GB3838-2002地表水环境质量标准都将藻毒素作为检测项目，并规定MCLR的含量应低于lugL。2）柱孢藻毒素理化性质柱孢藻毒素主要是一种生物碱类的肝毒素分子量为415Da，其结构如下图，它易溶于水，比较稳定。CYN还有另外两种主要的形式，分别deoxy

12、cylindrospermopsin(图4)和7-epicylindrospermopsin (图5)，其中CYN和7-epicylindrospermopsin是有毒的，而deoxycylindrospermopsin没有毒性，研究认为CYN结构上尿嘧啶上的羟基对于其毒性是必须的。毒性柱孢藻毒素主要作用于肝脏和肾脏组织，除此之外，肺、心脏和胸腺也是其主要作用器官。柱胞藻毒素能够抑制蛋白质的合成，以共价修饰改变DNA或RNA引起基因损伤。与柱孢藻毒素中毒有关的病理变化主要有四个阶段，分别是抑制蛋白质的合成，细胞膜的扩散，细胞内脂质聚集最后导致细胞死亡。对小鼠腹腔注射柱孢藻毒素，16h后发现粗面

13、内质网上的核糖体脱落，24h后光面内质网上膜有显著的扩增，并出现高尔基体，在48h发现在细胞内已经聚集了小脂滴，100h肝小叶中的肝细胞已经被破坏。3）节球藻毒素理化性质节球藻毒素和微囊藻毒素的结构相似，相对分子量为824Da也包含有一个Adda的结构，结构如图2所示。相对微囊藻毒素的7个氨基酸组成来说，节球藻毒素是由5个氨基酸组成，它缺少了微囊藻毒素的D-Ala和x，并且微囊藻毒素中的Mdha被换成了Mdhb。图6：节球藻毒素结构式毒性作为环状的五肽肝毒素，节球藻毒素能抑制丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶1和2A的活性，具有强烈的促肝肿瘤的作用，同时它不仅是肿瘤促进剂，而且是直接的致癌物质。（2）神经

14、毒素 神经毒素主要包括鱼腥藻毒素-a(anatoxina)、石房蛤毒素(saxitoxin)、新石房蛤毒素(neosaxitoxin)和膝沟藻毒素(gonyautoxin)等，后三种毒素统称为麻痹性贝毒。神经毒素由水华鱼腥藻、水华柬丝藻及螺旋颤藻等所产生。神经毒素具有不稳定、半衰期短、自然条件下即可迅速降解而失去毒性的特点。1）石房蛤毒素理化性质图7：石房蛤毒素结构式STX 的分子式C10H17N7O4, 分子量299, 具有2 个碱基。分子式中氮和氧的原子总数超过碳原子数, 7 个氮原子中有6 个以两个胍基形式存在。STX 纯品为白色固体, 易溶于水, 不被人的消化酶破坏, 遇热稳定, 在酸

15、性溶液中很稳定，可以保存在稀盐酸中数年而不失活性, 只有在高浓度酸溶液中才发生氨甲酰酯的水解; 在碱性条件下极不稳定, 可发生氧化反应, 毒性消失。毒性STX在温血动物中能够阻断神经传导而导致麻痹，最终由于窒息引起死亡，其小鼠腹腔注射LD50值为810g/kg。STX诸多的类似物由于结构不同致使毒性也相互差别很大。对于该类毒素造成的中毒，目前除对症治疗外尚无特异性的解救药。2）鱼腥藻毒素-a理化性质图8：鱼腥藻毒素-a结构式鱼腥藻毒素-a，相对分子质量165，极性强，溶于水等极性溶剂，在碱性条件下不稳定。毒性由于它的分子结构具有半刚性，是非竞争性胆碱酯酶抑制剂，对酶进行不可逆抑制。腹腔注射小鼠

16、，流涎、流泪、肌束震颤、尿失禁，在240 min 内呼吸衰竭死亡。活性高，毒性大。但神经毒素不稳定，半衰期短，尤其在光照和高pH条件下，可迅速降解为无毒。（3）其他毒素 脂多糖内毒素是蓝藻细胞壁的组成部分，由脂A、核心寡糖和0特异多糖组成。蓝藻脂多糖内毒素的脂A 与格兰氏阴性细菌的脂多糖不完全相同，种类更多，而且往往含有少量的磷酸。皮肤毒素包括aplysiatoxin、debromoaplysiatoxin和鞘丝藻毒素-a (1yngbyatoxina)等，主要从海洋蓝藻巨大鞘丝藻中发现，人在含有这些毒素的海域中游泳后会产生皮肤过敏、口腔和胃肠发炎等症状 。皮肤毒素可能是蛋白激酶c的活化剂，具

17、有促肿瘤作用。到目前为止，在淡水水体中还没有发现皮肤毒素。三、蓝藻的检测藻类的检测包括：藻类计数，叶绿素测定以及藻毒素的测定。叶绿素a测定1、抽滤后滤膜放入冰箱冷藏12-24h（使滤膜水分蒸发），取出滤膜放入离心管中，加少量碳酸镁粉末及3-5 mL 90%丙酮，用玻璃棒碾磨后，静止5min后用离心机（3000-4000r/min）离心10min,将上清液吸到10 mL容量瓶中。2、再加入3-5 mL 90%丙酮，继续碾磨提取，离心10min, 并将上清液吸到10mL容量瓶中，定容。3、将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm和630nm波长的吸光

18、度，并以90%丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。4、计算方法CHLa（mg/m3）V水样体积；0.5LV1提取液定容后体积（mL）；10mL比色皿光程（cm）；1cm藻毒素的测定目前对水体中藻毒素的检测已经有多种方法，主要是生物方法，化学方法，生化方法和免疫方法。1.生物方法传统的生物方法主要是是利用小鼠进行腹腔注射或者是经口灌喂来评价藻毒素的毒性。用纯化的或者是从水华蓝藻中粗提的藻毒素进行测试，根据小鼠的生理病变及半致死量可初步确定其毒性，这也是毒理评价的常用方法，此外还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究。利用原代肝细胞培养技术也可快速检测藻类毒素，谷康定等人用两

19、步灌流法制备大鼠原代肝细胞，经微囊藻毒素-LR处理后，数小时后细胞形态学即发生改变，但是多数传代细胞对微囊藻毒素不敏感。这类生物方法方法操作简单，还可以监测到过去未曾发现的新毒素，然而实验中要辆牲实验动物，受到道德伦理的约束，而且该方法的灵敏度较差，一般需要的毒素量比较大，所得到的结果与小鼠自身的品系有关，可比性较差，更重要的是该方法不能确定毒素的类型和结构。2化学方法化学方法主要包括气相色谱(GC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱质谱分析(LCMS)及毛细管电泳(CE)等，这些方法利用藻毒素的理化性质并结合灵敏的光电技术对其进行定性和定量分析，其中HPLC应用的最为广泛和成熟。3生物化学方法3.1 PCR方法PCR技术在藻毒素的检测和分析方法上的研究已经成为一个热点，该方法是建立在微囊藻毒素产毒基因的基础之上的，根据微囊藻的毒素肽合成酶基因设计引物，通过检测藻类基因组DNA中是否含有MC合成酶基因簇即mcy，初步判断被检藻株的产毒能力，可预测被测水体是