医学实验器材原理及应用 2014年

1、医学实验器材原理及应用（2014）第一章1何谓卫生技术、实验室技术？卫生技术：用于卫生保健和医疗服务系统的特定知识体系，包括药物、器械设备、卫生材料、医疗方案、技术程序、后勤支持系统和行政管理组织。实验室技术：用于科学实验活动(研究、教学、科技创新、检验等)的实验材料（试剂与材料）、仪器设备、实验程序及其相关知识和组织管理技术、支持技术体系。2现代卫生装备技术与医学发展间的相互作用主要特征体现在哪几方面？4个正向效应 1个负向效应正向效应 效应1. 医学装备技术推动着医学进步效应2. 新技术促进了新学科的形成效应3. 技术的扩布改变了某些学科的传统认识及格局效应4. 技术牵动着某些医学程序改革

2、负向效应特征：技术发展与卫生资源的动员形成矛盾第二章1. 常用的组织细胞破碎的方法有哪几种？物理法:机械法: 研磨、(捣碎)、匀浆、超声、挤压；反复冻溶(-15-20，冰箱等制冷环境)、急热骤冷化学及生化法：自溶、酶解、化学渗透（表面活性剂处理、有机溶媒等，细菌、细胞）2. 试举两种组织细胞破碎仪器，简述其主要通过何物理作用？主要用途？（1）研磨式组织细胞破碎仪 物理作用：碾压、机械切力。目的：制备组织浆液，提取存在于组织、细胞内的物质或为细胞破碎做准备。（2）超声细胞破碎机 物理作用：超声振动空穴效应冲击波和剪切力。目的：细胞破碎。3. 超滤要解决常规过滤所遇到的主要技术难题是什么？并说明解

3、决这一难题主要从哪三个因素考虑？目前，实验室常的超滤方法有几种。试举出俩种？浓度极化：大分子聚集浓度梯度浓度极化次级膜阻碍选择性分离，流速¯ 三个因素：1.加大压力-凝胶层；2.搅动；3.切向流。 超滤方法：4种 真空透析超滤、离心浓缩超滤、加压搅拌室超滤、切向流系统超滤。4. 减压蒸发时，压力温度直线图的应用？应用：（1）某种液体常压沸点为100，希望在20下蒸发，两者连线得出需控制减压为50 mmHg。（2）减压：通过系统连真空泵完成。5. 真空冷冻干燥的基本定义。真空冷冻干燥，也称升华干，是将材料冷冻，使其含有的水份变成冰块，然后在真空下使冰升华而达到干燥目的。6如何根据待冻干

4、样品的共晶点设置冻干条件（冻干温度，安全温度）？在升华过程中，物料温度应维持在低于而又接近共融点的温度。在干燥过程中样品的温度只由真空度决定, 而不受搁板温度或外界温度控制。在干燥的初始阶段, 根据水的冰上蒸气压曲线，样品温度和真空度成比例, 样品的温度与搁板的温度无关。在干燥过程中重要的一点是使样品不能融化, 因而干燥的温度必须低于共晶点温度1015 。为保证样品在最大的安全下干燥, 有必要使之运行在安全压力下. 如果干燥室内的真空度上升, 达到安全压力, 搁板将停止加热, 升华过程变缓, 因而防止了样品的融化。安全温度应低于共晶点温度7 或 5，根据冰上蒸气压曲线可得出安全真空度。7.离心

5、技术的基本定义，常用离心制备技术有哪两种？离心(Centrifugation)：是利用旋转运动的离心力以及被离心样品物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩、提取制备生物样品，分析测定生物大分子分子量及纯度的重要实验技术。差速离心和密度梯度离心8.简述差速离心的基本概念？利用离心样品组份中不同S值的颗粒沉降速度不同，经一定速度一定时间离心而先后沉淀达到分离效果。在此过程中样品往往被分离为沉淀物和上清液两部分。9. 如何将文献报道的离心力（或转速），时间，经计算转换到实验室现有相应离心机上？S = K/t 或t = K/S T2 = T1 × K1/K2已知时间和RCF转换：t1&

6、#215;RCF1 = t2×RCF2 t2 = t1×RCF1/RCF210. 长期使用超低温冰箱，要定期进行的是哪两项保养措施？定期除尘、除霜。第三章1. 细胞培养的定义？ 组织细胞培养：从动物活体内取出组织或经分离得到的细胞于模拟体内生理生化环境等特定体外条件下进行孵育培养，使之生存并生长的过程。细胞培养(Cell Culture) ：是把组织用机械或消化办法分散成单个细胞悬液，而后进行培养生长。2. 细胞培养的必要条件是什么？必要条件：无菌 温度 pH 渗透压 体外培养细胞生存所需基本物质 附着底物 3.CO2培养箱的内部工作环境应符合的条件。一般说来培养箱的内部工

7、作环境中下列因素应符合一定的条件：温度 相对湿度 CO2浓度 O2浓度（选配） 无菌条件4. 在CO2培养箱中，CO2的主要作用是什么？CO2调节培养基PH的化学反应式。CO2作用：既是细胞的代谢产物，也是细胞所需的成分，它主要与维持培养基的PH有直接关系。反应式：CO2+H2OH2CO35. 净化工作台分为哪两类？简述水平风式和垂直风式净化工作台的区别和优缺点？分类：水平风式和垂直风式区别及优缺点：（1）垂直风式: 气流是从上至下流动，在操作者前方形成了一个风屏，但由于气流负压作用裹夹气体进入。（2）水平风式: 净化空气是经台上方和台内侧水平吹出，气流向外移动，不易混入外界气体，但操作有害物

8、质时对操作者构成不利。6. 培养细胞的生长方式？贴附生长 悬浮生长7. 贴附培养细胞的生长过程？生长过程：游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期、停止期（平台期）8接触抑制和密度抑制定义？接触抑制：正常细胞存在连续不间断活动（移动），其外周呈现出特征性皱褶样活动，当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去时发生细胞接触，细胞不再移动，接触区域细胞膜皱褶样活动停止。密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，导致细胞分裂停止。9.冷冻速率和复温速率的定

9、义？冷冻速率：是指降温速度，它是影响活细胞能否被冷冻到一个能永久保存温度主要因素。不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，可能会对细胞造成损伤。复温速率：是指细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存的细胞复苏时，复温速率不当也会降低冷冻存活率。一般来说复温速度越快越好，37水浴中，1-2分钟内要完成复温。10. 细胞污染物检测包括哪些？细菌和真菌污染检测：a肉眼直接观察法 b培养检查法 c显微镜观察法支原体检测：a相差显微镜观察法 b Hayflick培养基直接培养法 c DNA荧光染色法病毒检测：a致细胞病变效应或集落检测 b血细胞吸附试验 c鸡胚接种细胞间交叉污染11. 细胞工程学概念概念

10、：应用细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论和方法，通过类似工程学的步骤，在细胞或细胞器水平上按照人们的意愿来改造细胞内的物质，改变生物的结构和功能，已获得新的生物物种、品种或特种细胞产品的一门综合性技术。12. 例举3-4个细胞融合技术。仙台病毒(HvJ)诱导法 聚乙二醇(PEG)化学诱导法 细胞电融合技术 激光诱导法 高通量细胞融合芯片 空间细胞融合技术 离子束融合技术13. 例举2个染色体分离技术。微细玻璃针切割法 显微激光切割法14.什么是细胞拆合工程？细胞质工程，又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。可用于

11、研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。 15. 无血清培养优缺点？优点：（1）可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。（2）避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。（3）避免血清组分对实验研究的影响。（4）有利于体外培养细胞的分化。（5）可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。缺点：（1）不同细胞系对无血清培养液的适应性各不相同缺乏广泛的通用性（2）价格高，不适宜高密度培养（3）驯化过程长且克隆不稳定（4）不能维持细胞无限生长16. 动物细胞培养的特点?（1）绝大多数为哺乳类动物细胞（2）动物细胞对营养的要求较高（3）动物细胞对培养环境的适应性较差，生长缓慢，培养

12、时间较长（4）对环境条件要求严格 pH CO2（5）各种污染的防治问题（6）长时间培养使原有的细胞功能、形态及分化特征发生变化或变异17大规模动物细胞培养的操作方式有哪些？分批式培养 流加式培养（ 单一补料分批式培养、 反复补料分批式培养） 半连续式培养 连续式培养 灌流式培养第四章1. 在使用普通透射光正置显微镜做明视场观察时，怎样计算光学显微镜的分辨率？公式：D =/ NA 波长(nm)，NA 数值孔径2.何谓光学显微镜的有效放大？有效放大：所用物镜NA值的5001000 X3. 在用光学显微镜观察和照相时，如何调置聚光镜NA值与物镜NA值的对应关系，分别追求的主要效果是什么？NA大，光栅

13、疏 主极大连多个次极大（明 暗） NA小，光栅密 主极大仅各两2个次极大（1）增加反差分辨（2）不同倍率物镜有不同的NA值（3）需与聚光镜NA值作对应调整4. 提高光学显微镜分辨率的主要措施？（1）增大物镜孔径角；（2）降低光源波长的值；（3）增大值提高NA ；（4）增加镜像的反差：调整好聚光镜NA与物镜NA的对应比例；调节视场光阑，屏蔽杂散光。5简述相差显微镜的原理，相差装置的调整主要目的及要达到的光学效果是什么，需借助的主要工具是什么？基本原理：利用被检体的光程(折射率与厚度的乘积)之差，有效利用光的干涉现象，将人眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差。相差装置调整的主要目的：调整聚光镜相差

14、环的环状光阑成像与相差物镜的相板共轭面完全吻合。环状光阑：造成光程不同，偏斜/衍射。产生直射光及衍射光。相(位)板： 共轭面(半透明环) 通过直射光，补偿面(中间) 通过衍射光。达到的光学效果：两光合成干涉振幅差的形成。需借助的主要工具：相板，相板上相位膜(涂氟化镁)：+相板、-相板，分别用于推迟直射光和衍射光的相位。由于共轭面与补偿面性质不同 光线相位差、强弱不同 物镜后透镜聚合 干涉(振幅差)。6.显微摄影的基本定义？.将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术。7. 什么是显微操作系统？显微操作技术包括什么？显微注射的仪器组成？显微操作系统：由倒置显微镜和显微操作仪两部分构成.显微操作

15、仪包括密封的微量注射器,细塑料管和玻璃微吸管,整个系统都由液体(蒸馏水,硅油或石蜡油等)充满。 包括：细胞核移植 显微注射 嵌合体技术 胚胎移植 显微切割. 组成：(1).显微拉针仪 (2)煅烧仪(微熔灯) (3)显微磨针(尖)仪 (4)显微操作系统 (5)附助设备:解剖镜, CO2培养箱, 超净工作台8.简述显微注射固定针的制作过程？(1)拉针仪拉制:调节拉针仪参数将毛细玻璃管拉成外径适当的小管(2)断开:在锻烧仪铂金丝或加热丝的小玻璃滴上,在小管外径为80100m处断开(3)烤制:小管断开后,调节微调使小管撞击去掉尖细部分,然后把留下的吸管之断口靠近烧红的玻璃滴加热,使之烧化,就可烤制成内

16、径为2030m末端纯圆的固定吸管。9.什么是超排卵？超排卵：为了获得更多的胚胎，人们模拟体内发育成熟与排放的激素调节模式，通过注射不同的促性腺激素刺激暂时处于休止状态的卵母细胞进入成熟发育期， 成熟后排放于输卵管。由此可获得比自然排卵时多得多的卵母细胞或胚胎，称为超排卵。10.显微注射转染外源基因的优缺点？优点：目前建立转基因动物极为重要的方法：可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制，可达100kb ；实验周期相对比较短。缺点：(1)基础费用太高:显微操作用的设备太昂贵,限制了大多数技术的实际应用。显微操作的成功率与操作者的技术和经验相关：注射微管质量、注射

17、位置、显微镜的光源强度、注射体积。(2)操作后胚胎的成活率低。(3)导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。(4)每次只能注射有限的细胞数目。11. 影响转染效率的因素？影响外源基因表达的质粒因素有哪些？影响转染效率因素：传代次数 细胞融合率 支原体污染。 质粒因素：质粒的拷贝数和稳定性。12. 瞬时转染和稳定转染的区别？瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后

18、24-96小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，半乳糖苷酶等来帮助检测。稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/10 4 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。在加入选择性试剂之前，被转染的细胞至少要在标准培养基中培养过夜。这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。那些未成功转染

19、质粒的细胞即被杀死。而只有那些成功转染的细胞能够生长。13. 实现转染的三大主策略是什么？转染技术主要是基于三种不同的策略来实现 1）利用运送体分子，如磷酸钙、 DEAE-（二乙胺乙基）右旋糖苷，阳离子脂质体试剂和新复合组分的转染试剂； 2）直接输送，如电穿孔、基因枪和显微注射 3）病毒载体。14. 激光捕获显微切割技术主要用于从实体组织中分离出的研究对象包括哪些？同质细胞群、单个细胞甚至亚细胞结构15. 比较激光捕获显微切割技术与流式荧光细胞分选技术的优劣？LCM是目前从组织或细胞单层分离亚群细胞的有效方法，同时实现将组织中每种细胞群作为研究对象，其分子表达谱会非常接近体内状态。LCM技术能

20、够使我们分离得到特异的目的细胞，而没有周围细胞的污染。细微：研究对象可以达到m 级原位：在组织细胞原位取材，定位清楚、准确同质：保证获得同质研究对象结合：分子生物学、免疫学及病理学研究16. 激光捕获显微切割前进行免疫染色的意义。免疫染色：是在LCM之前进行免疫组化或免疫荧光染色，增强在复杂组织中对目的细胞的鉴别能力，可以在形态上相似的细胞中选出在免疫表型上明显不同的细胞，如B和T细胞，实现对功能分类后的细胞进行分选。17. 利用激光捕获显微切割技术进行GFP 标记的活细胞筛选的目的。筛选稳定转染目的基因的细胞群18. 什么是图像数字化？简述其基本步骤。利用计算机进行图像分析时，首先将可见图像

21、转变成数字图像，称为模拟图像数字化。基本步骤为：抽样、量化。抽样就是把时间和空间上连续的图像变成离散点集合的一种操作, 这些离散点即为抽样点, 称为像素或像点。量化：把各个像素点的明暗程度变成灰度值的过程称为量化。抽样后各个像素点的明暗度即其灰度是连续量，把它离散化使其成为有限个整数值。8 位/像素，就有(28 ) 0 255个灰度级。16位/像素，就有（216 ）0 65535个灰度级。19. 显微图像分析的主要参数？整合平均光密度和面积比。20. 计算机免疫组化图像分析的原理是什么？（1）利用专业的图像分析软件，可以迅速得到全面和精确的免疫组化图像的量化结果。（2）免疫组化染色程度与抗原量

22、存在着很好的线性关系，好的免疫组化片能真实的反映抗原含量的多少，这是对免疫组化结果进行光密度测量进而实现定量分析的基础。21. 光密度的定义？（optical density,OD值）光密度的主要评价参数有哪些？光密度（optical density，OD值）是光学测量中的概念，定义为吸收光线物质的光学密度，与该物质的物理密度应该是线性相关的。光密度主要评价参数：积分光密度和平均光密度。第五章1. PCR的主要步骤及相应的温度范围？变性 95 退火 与Tm有关 延伸 722.简要说明PCR实验中引物设计的基本要求？基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体

23、或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 几个要点：（1）引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。(3)引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发

24、夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。(4)引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。(5)引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)。(6)G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(7)引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5k

25、cal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。(8)对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。3.试述电泳上样缓冲液成分及作用？Tris-Hcl；SDS；溴酚蓝；甘油；-巯基乙醇SDS是保证样品中的所有蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；还原剂-巯基乙醇是让二硫键处于断开状态，保证蛋白分子的线性；溴酚蓝作用是指示上样蛋白的跑胶时标记的；甘油是增加上样重量的，以免漂浮。4.常用的循环数与初始靶浓度之间的关系为？常用的循环数与初始靶浓度之间的关系为：靶分子数 循环数3 × 105 203

26、01.5 × 104 30351 × 103 35405 40455 .比较说明Southern,Northen,Western印迹（Blotting）应用上的不同？DNA RNA 蛋白质Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之间碱基互补配对的特异性识别能力，而Western Blotting则基于抗原抗体之间特异的免疫反应。Southern Blotting和Northern Blotting时使用带有标记（如同位素标记或荧光标记）的DNA或RNA探针去识别并结合到待检测核酸上，然后直接显影；而Western Blo

27、tting时要先用待检测蛋白的“一抗”结合到待检测蛋白上，再用可识别“一抗”并偶联了某种酶的“二抗去检测”一抗“，最后通过显色反应的信号来显示待检测蛋白的存在与否及量的多少。 另外，Southern Blotting和Northern Blotting两者比较容易混淆。这两种技术最关键的区别在于待检测核酸的属性，如果被检测的是DNA，则该技术就是Southern Blotting，其探针可以是DNA也可以是RNA；类似地，如果被检测的是RNA，不管探针是RNA还是DNA，该方法就叫作Northern Blotting。6. 影响电泳迁移率的几个因素？（1）、样品的物理性状 （2）.支持物介质

28、（3）.电渗 （4）.电场强度 （5）.缓冲液离子强度 （6）.焦耳热7什么叫变性？什么叫迁移率？通过加热可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA，此即为DNA高温热变性。迁移率(又称泳动率)是带电荷颗粒在一定电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。8.PCR操作时应注意把哪些区域分离？下列两种工作区域应隔离：A.PCR前 B. PCR后称量试剂 PCR产物电泳配制缓冲液 PCR产物加工提取DNA 分析和测序PCR产物准备PCR原液 储备产物用于第二次扩增准备PCR9. 荧光定量PCR技术中的概念：CT值。PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过扩增循环数

29、。10. 简述HMR技术。高分辨熔解曲线分析技术是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。11. 如PCR产物为200bp,可用何种电泳介质检测，如要想得到较好的分辨率，应采用哪种电泳介质检测为宜？琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳12. 试述在SDS-PAGE法测定蛋白质分子量中试剂SDS的作用？SDS能断裂分子内和分

30、子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。13. 按凝胶的形式，有哪几种分离核酸的电泳方式?琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳14. 有302nm和360nm两个波长的UV透射检测仪，用于EB染色核酸电泳成像和切胶回收样品时，分别应选用哪个波长，为什么？短波254nm的紫外线是由核酸