1.1DNA重组技术的基本工具学习课程

1、第1页/共31页第一页，编辑于星期四：二十点 四十分。 DNADNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明 DNADNA双螺旋结构和中心法则的确立双螺旋结构和中心法则的确立 遗传密码的破译遗传密码的破译 基因转移载体的发现基因转移载体的发现 工具酶的发明工具酶的发明 DNADNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明 DNADNA体外重组的实现体外重组的实现 重组重组DNADNA表达实验的成功表达实验的成功 第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世 PCRPCR技术的发明技术的发明基础理论基础理论技术发明技术发明第2页/共31页第二页，编辑于星期四：二十点 四十分。重组重组DNA导入导入拼接拼接

2、普通棉花不具有抗虫性，科学普通棉花不具有抗虫性，科学家发现苏云金芽孢杆菌能够产生一家发现苏云金芽孢杆菌能够产生一种毒蛋白，对棉铃虫有一定的杀伤种毒蛋白，对棉铃虫有一定的杀伤作用。作用。试设计一个简单的方案，使棉花对试设计一个简单的方案，使棉花对棉铃虫也有抵抗作用棉铃虫也有抵抗作用. .第3页/共31页第三页，编辑于星期四：二十点 四十分。第4页/共31页第四页，编辑于星期四：二十点 四十分。第5页/共31页第五页，编辑于星期四：二十点 四十分。 第一节 DNA重组技术的基本工具第6页/共31页第六页，编辑于星期四：二十点 四十分。DNA重组技术的基本工具 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）

3、 DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） 基因转移工具（“分子运输车”）基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：因操作最少需要以下三种工具：第7页/共31页第七页，编辑于星期四：二十点 四十分。第8页/共31页第八页，编辑于星期四：二十点 四十分。来源来源种类种类作用作用作用结作用结果果阅读课本4-54-5页“限制性核酸内切酶分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习自主学习主要从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约40004000种1 1、

4、识别双链DNADNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸的两个核苷酸之间的之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。第9页/共31页第九页，编辑于星期四：二十点 四十分。12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构第10页/共31页第十页，编辑于星期四：二十点 四十分。 G1234512345 A3,5-3,5-磷磷酸二酯键酸二酯键3端5端3端5端磷酸二酯键磷酸二酯键第11页/共31页第十一页，编辑于星期四：二十点 四十分。12仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有何识别的特定序列有何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的

5、序列的特限制酶所识别的序列的特点是：点是：呈现碱基互补对称，无论是6 6个碱基还是4 4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是反反向对称重复向对称重复排列的 ，称为回文序列第12页/共31页第十二页，编辑于星期四：二十点 四十分。中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用第13页/共31页第十三页，编辑于星期四：二十点 四十分。黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单两条单链的切口，带

6、有几个链的切口，带有几个伸出的核伸出的核苷酸苷酸，他们之间正好互补配对，他们之间正好互补配对，这样的切口叫这样的切口叫黏性末端黏性末端。第14页/共31页第十四页，编辑于星期四：二十点 四十分。SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割第15页/共31页第十五页，编辑于星期四：二十点 四十分。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割当限制酶当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，从识别序列的中心轴线处切开时，切开的切开的DNADNA两两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平

7、末端。第16页/共31页第十六页，编辑于星期四：二十点 四十分。你能推测限制酶存在于原核生物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切安全。所以

8、，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，从而达到从而达到保护自身保护自身的的目的。目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶的不具备这种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者或者通过甲基化酶将甲基通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的制酶也不会使自身

9、的DNADNA被切断，并且可以被切断，并且可以防止外源防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 第17页/共31页第十七页，编辑于星期四：二十点 四十分。类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针”DNA连接酶的相关内容，填写下表自主学习第18页/共31页第十八页，编辑于星期四：二十点 四十分。把切下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将，即将脱脱氧核糖氧核糖和和磷酸磷酸连接起来催化形成连接起来催化形成磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用连接酶的作用第1

10、9页/共31页第十九页，编辑于星期四：二十点 四十分。两两DNADNA片段要具有片段要具有互补的互补的黏性末端黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，但不能连接单链单链缺口，但不能连接单链DNADNA！第20页/共31页第二十页，编辑于星期四：二十点 四十分。DNADNA连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连

11、接酶的缝合作用第21页/共31页第二十一页，编辑于星期四：二十点 四十分。DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象 作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接只能将单个核苷酸连接到已有的到已有的DNADNA片段片段上，上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键在两个两个DNADNA片段片段之间之间形成磷酸二酯键第22页/共31页第二十二页，编辑于星期四：二十点 四十分。限制性

12、内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCCGGATCC，限制，限制性内切酶性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATCGATC。在质粒上有酶。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1 1）请画出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2 2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末切割后所形成的黏性末端。端。（3 3）在）在DNADNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的

13、黏性末端能否连接？为什么？的黏性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）的黏性末端是相同的（或是可以互补的） 第23页/共31页第二十三页，编辑于星期四：二十点 四十分。载体的作载体的作用用载体的必要条件载体的载体的种类种类阅读课本第6 6页“分子运输车”运载体的相关内容，填写下表自主学习自主学习细菌的质粒细菌的质粒病毒：病毒：、动植物病毒等、动植物病毒等。 第24页/共31页第二十四页，编辑于星期四：二十点 四十分。有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别素的培养基

14、鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带能复制并带着插入的目着插入的目的基因一起的基因一起复制复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNADNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNADNA分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。第25页/共31页第二十五页，编辑于星期四：二十点 四十分。随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序 列B、EcoRI切割的是GA之间的氢键C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切 割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中答案答案：C第26页/共31页第二十六页，编辑于星期四：二十点 四十分。2. （多选）答案：答案：BD第27页/共31页第二十七页，编辑于星期四：二十点 四十分。3.3.下列四条DNADNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A A B B C C D D答案：答案：D第28页/共31页第二十八页，编辑于星期四：二十点 四十分。DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” 作用作用把两条把两条DNADNA末端之间的缝隙末端之间的缝隙“缝合缝合”起来。起来。G A A T T C C T T A A G 即脱氧核糖